周小勻,周 琰 綜述,郭 瑋 審校

復旦大學附屬中山醫(yī)院檢驗科,上海 200032

聚合酶鏈反應(PCR)是一種用于體外擴增和檢測低濃度核酸的技術,它可以從少量的起始材料中產生幾百萬份特定的DNA片段的拷貝,目前在分子生物學領域有著非常廣泛的應用。傳統(tǒng)的終點PCR只能提供相對和定性結果,后續(xù)的第二代PCR——實時熒光定量PCR(qPCR)通過熒光探針或染料進行靶向擴增實現了定量檢測,但由于熒光基線估計誤差和qPCR擴增效率導致的擴增偏差問題,仍然無法提供準確的絕對結果。

1992年SYKES等建立了數字PCR(dPCR)的基本實驗流程之后,“第三代PCR”——dPCR技術迅速發(fā)展起來并日趨成熟。2003年,DRESSMAN等結合dPCR技術和流式技術,應用乳狀液在單個試管中實現了PCR反應體系的分隔。在商業(yè)化方面,2006年,Fluidigm公司最先推出了基于芯片的dPCR平臺,Quantalife公司研制了最早的微滴式dPCR系統(tǒng)。如今,dPCR技術因其在分子檢測方面的高靈敏度和高準確性,已在微量DNA檢測、罕見突變檢測和拷貝數變異等方面得到了廣泛應用。

1 dPCR的原理、分類

1.1dPCR的原理 dPCR核酸分子定量方法的原理是基于熒光PCR 擴增與計數,但無須Ct值和標準曲線即可實現定量。在dPCR中,擴增反應被分成數千個獨立的部分,分區(qū)可以通過微孔板、毛細管、油乳液或陣列來實現。理想情況下,每個單獨的反應混合物含有一個或沒有目標分子,待分割后的反應擴增至終點,計數陽性(熒光)和陰性分區(qū)的數量,即可通過泊松定律精確計算每個分區(qū)的DNA目標數和原始標本中的拷貝數[1]。使用dPCR準確定量DNA須滿足以下兩個條件:第一,DNA目標必須隨機分布于分區(qū)中,理想情況下每個分區(qū)不應該包含一個以上的目標分子,但這一稀釋需要大量的分割(104～105)才能達到泊松定律的要求。分區(qū)的大小也應該一致以使每個分區(qū)包含相同數量的目標分子。第二,擴增須有足夠效率,讓所有包含目標分子的分區(qū)都被擴增,且正負分區(qū)間須有明確區(qū)分。

1.2dPCR的分類 目前主流的dPCR技術可分為液滴式dPCR(ddPCR)和芯片式dPCR(cdPCR)。

ddPCR使用兩種互不相溶的液體,通過兩者表面張力和剪切力的共同作用來形成微小的液滴。在ddPCR中,微滴發(fā)生器每次可以生成數百萬個納升級別的油包水微滴作為樣品分散載體,這些液滴將包裹著單拷貝的DNA模板和反應液進入反應管擴增,最后通過檢測微滴的熒光信號進行定量。該方法的優(yōu)勢在于靈活的通量及可擴展性,但其生成液滴的穩(wěn)定性及可控性較差。相應的商品化儀器平臺包括 Bio-Rad-Qx 200、RainDrop、Naica Crystal、新羿 TD-1 數字 PCR 儀和達微生物 OsciDrop?等。

cdPCR技術先在芯片上物理加工大量的腔室陣列作為微反應腔室,再將納升級液體封閉在微孔中進行擴增,最后使用熒光顯微鏡判讀結果。近年來芯片產業(yè)的進步大大推動了cdPCR的發(fā)展: Ismagilov研究組開發(fā)了滑動式dPCR芯片[2];浙江大學研究組開發(fā)了具有分支結構的無廢液式芯片和一體式dPCR芯片[3]。cdPCR獨立性高、反應均一性好,為實時dPCR提供了可能性;但其芯片加工制作工藝要求高,技術操作復雜且實驗成本較高。商品化儀器有Thermofisher QuantStudioTM3D、Clarity、QIAGEN QIAcuity等。

1.3dPCR商業(yè)化平臺 目前dPCR市場中的主要商業(yè)品牌有QX系列(Bio-Rad公司,美國),RainDrop系列(Bio-Rad公司,美國),BioMark 系列(Fluidigm Corporation公司,美國)和 QuantStudio 系列(Thermo Fisher公司,美國)。前兩者屬于ddPCR技術,后兩者屬于cdPCR技術。其他品牌有Clarity(JN MedSys公司,新加坡)、Naica(Stilla Technologies公司,法國)等。

1.3.1BioMark系列 Fluidigm Corporation早在2006年就開始著力于將dPCR技術商業(yè)化。其推出的BioMark HD平臺,使用數字陣列集成流體電路 (IFC) 將樣品分成770個0.85 nL體積的分區(qū),通過在每個IFC中使用微流體結構,可以將樣品和化驗溶液加壓加載到反應分區(qū)中。之后,BioMark HD 執(zhí)行原位熱循環(huán),最后借助平面成像技術進行終點和實時熒光檢測。此外,BioMark系列通過使用多種報告染料對標本目標進行量化,可以有效消除假陽性。

在科研應用方面,ALIKIAN等[4]使用基于 BioMark的 dPCR 平臺,對慢性粒細胞白血病BCR-ABL1基因拷貝數進行定量,效果明顯優(yōu)于qPCR。

1.3.2QuantStudio系列 Thermo Fisher Scientific 的 QuantStudio系列包括QuantStudio 3D dPCR 和 QuantStudio 12 K Flex with OpenArray Plates等平臺。QuantStudio 3D dPCR 芯片具有20 000個0.8 nL的反應孔。樣品加載到芯片上是通過使用預先吸取樣品的一次性加載刀片實現,之后自動芯片加載器可以將樣品分配到芯片,該系列設備的價格目前在市場上處于較低水平。

1.3.3Bio-Rad QX系列 Bio-Rad QX 系列是目前市場上相當流行的ddPCR儀器,目前提供QX100、QX200和QXONE dPCR等設備。QX200具有用于液滴生成和熒光檢測的獨立單元,可生成約 20 000個納升大小的液滴。其操作流程:使用定制混合溶液制備樣品,然后借助液滴生成油通過流動聚焦形成液滴,最后送入熒光檢測器。 SUO 等[5]最近的一項研究顯示,使用QX200進行新型冠狀病毒感染(COVID-19)的檢測,可報告范圍為10～5×104拷貝/反應,在患者咽拭子標本中,尤其是在病毒載量處于低水平時,較qPCR顯示出高精度和靈敏度,但QX200在使用中需要手動移液,在開放環(huán)境中有一定的污染風險。

1.3.4Raindrop系列 Raindrop 采用 ddPCR 技術,可對超過100萬個皮升大小的液滴進行高通量處理和實時成像。該設備在單個微流體平臺上結合了快速液滴生成、片上熱循環(huán)和廣域熒光成像技術。與 QX 系列不同,RainDrop 在生成的單層液滴上使用平面成像技術,并從密封的機載儲液器自動輸送過濾油以消除污染風險。RainDrop 系統(tǒng)在幾個重要應用中都展現出了卓越的分子檢測性能,包括低頻腫瘤等位基因檢測、基因表達、拷貝數變異和單核苷酸多態(tài)性(SNP)測量。

對比來看,ddPCR儀器由于不受芯片制造分辨率的限制,可以利用微流體的優(yōu)勢產生更小的體積,因此QX200、RainDrop系列可以生成更高的分區(qū)數?；?cdPCR 的 QuantStudio 3D、Constellation/QIAcuity也已能在小于2 nL的體積內實現10 000個以上的分區(qū)。

2 dPCR與其他分子診斷技術的比較

2.1dPCR與qPCR的比較 如表1所示,dPCR和qPCR在熒光測定、擴增影響、檢測限、定量方式等方面均有不同。由于使用的標準曲線可能是通過不同方法標定的,不同實驗室對同一標本進行的qPCR檢測可能會得到不同的拷貝數。因此dPCR的主要優(yōu)勢在于其絕對量化不依賴校準曲線實現,提高了實驗室之間結果的準確性和可交換性[6]。若樣品中雜質阻礙了擴增,或靶標、引物、探針序列不匹配降低擴增效率,都會導致qPCR定量結果偏低。而dPCR定量使用終點檢測而非實時擴增,定量受標本中可能存在的擴增抑制劑的影響較小,也較少受到擴增效率不佳的影響[7],甚至能在不事先提取核酸的情況下對標本進行dPCR檢測[8]。dPCR可以更精確、靈敏地量化一些靶標,例如能夠對于監(jiān)測抗病毒治療的低病毒載量實現精準定量[9]。與qPCR相比,dPCR的更高精度也有助于檢測和定量罕見變異[10]以及測定反應中高拷貝數和低拷貝數靶點的比率。

表1 qPCR與dPCR的比較

dPCR也存在一些不足,有限的標本體積會限制檢測的下限,有限數量的分區(qū)會使得動態(tài)范圍較小,分子丟失會導致錯誤的量化偏低,即在一個分區(qū)中并不能確保所有的模板都被擴增。qPCR儀器能夠測量4～6種不同染料的熒光,這些染料與樣品中不同的目標結合在一起,而大多數dPCR儀器可以測量2種熒光染料,限制了同一標本中不同目標的多重檢測能力?？偠灾?dPCR與qPCR因定量方式等方法原理上的差異而各具優(yōu)勢,實驗室可以根據不同的檢測需求與應用場景選擇合適的檢測方法。

2.2dPCR與下一代高通量測序(NGS)的比較 NGS包括全外顯子組測序、全轉錄組測序、全基因組測序以及靶向高通量測序等。基于其邊合成邊測序的核心原理,NGS可以用來對整個基因組進行測序,也可以被限制在特定的目標區(qū)域。因此NGS屬于非靶向全基因組分析,能夠在不事先知道腫瘤中可能存在的畸變位點種類的情況下檢測腫瘤特異性改變;而dPCR技術則需要根據相關基因位點的特定突變事先設計引物探針來實現檢測定量。NGS的優(yōu)勢在于其通量高、速度快、精度高等,因而在臨床疾病分子診斷方面發(fā)揮著獨特作用。COVID-19疫情初期,NGS技術僅用5 d就獲得了病毒全基因組序列[11]。在腫瘤相關基因位點突變的檢測中,NGS平臺對血漿cfDNA中EGFR突變檢測的靈敏度為0.2%,批內精密度、批間精密度、準確度均為100%[12];dPCR平臺的檢出限為0.308 copy/μL, 準確度為87.88%[13]。NGS也存在一些問題,尤其是在被應用于低水平RNA的分析時,這通常與整個轉錄組(RNAseq)有關。

dPCR平臺可以與NGS對接,對測序文庫進行質量控制、提供對測序文庫的定量分析和質量評估信息。dPCR可以對NGS的結果,如對SNP、突變及拷貝數變異(CNV)在內的基因組變異等測序結果進行驗證,以確保測序結果的可信度。另外,dPCR所得到的結果還包含反映測序文庫質量的信息,如接頭與接頭二聚體、錯誤連接片段、過長連接片段等,這種優(yōu)勢是當前其他方法不具備的?？偟膩碚f,dPCR與NGS是兩種原理完全不同、能夠滿足不同檢測需求的分子檢測技術,dPCR技術能夠在質量控制或驗證等方面支持NGS。

3 dPCR在臨床檢測中的應用

dPCR在生物醫(yī)學領域的兩個主要應用是罕見突變檢測和核酸定量。dPCR主要應用于病原體檢測、CNV檢測、microRNA (miRNA)表達分析、下一代測序、單細胞基因表達分析和染色體異常檢測。

3.1病原體檢測 dPCR中眾多的單個反應分區(qū)使研究病原體的單細胞基因組學成為可能。一種名為“IC 3D”的基于液滴的系統(tǒng)已被成功用于在幾分鐘內檢測血液中的單個細菌[14]。在人類巨細胞病毒(HCMV)檢測中, QX100TM系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories?)和BioMarkTMHD系統(tǒng)(Fluidigm?)兩種dPCR系統(tǒng)同時用于標本檢測。其中,使用BioMark系統(tǒng)檢測得到的病毒拷貝數比傳統(tǒng)方法檢測血漿及PBS中提取的DNA分別高出26%和53%。PAVSI等[8]以外周血為標本,用dPCR對標本中HIV的 2-LTR序列進行檢測,結果顯示dPCR能對治療過程中HIV載量的微量變化進行有效檢測,且檢測精確度較熒光 PCR高出至少20倍。

微滴式dPCR方法已經被建立并用于檢測布魯菌, ddPCR檢出靶標基因拷貝數為1～2.00×105拷貝/反應,測得值的對數值與DNA濃度的對數值有線性關系,陽性率在布魯氏菌病疫情相關血液標本DNA的檢測中遠高于培養(yǎng)法和試管凝集法[15]。利用ddPCR技術,結合Taqman熒光探針技術對新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)ORF1ab基因和N基因保守區(qū)進行特異性檢測的試劑盒經檢驗符合產品技術要求,獲得了歐盟市場準入資質,具有靈敏度高、可定量、操作簡便和封閉檢測等特點,有利于定量監(jiān)測SARS-CoV-2載量,在SARS-CoV-2核酸超敏定量檢測方面具有創(chuàng)新性,達到國內領先水平。2022年,華西醫(yī)院已開展基于五色熒光ddPCR法的血流感染檢測,覆蓋血流感染中常見的16種細菌、8種真菌、5種病毒,以及碳青霉烯類、甲氧西林、萬古霉素、多黏菌素、青霉素等常見藥物相關的20個耐藥基因。cdPCR檢測肺炎克雷伯菌靈敏度比qPCR提高了約1.5個數量級,最低檢出限可達到3.77 copy/μL[16]?？偟膩碚f,在病原體檢測中,dPCR已經被證明能夠成功檢出各種樣品中低目標濃度的待測物且結果可靠,已在臨床檢測中有一定的應用。

3.2CNV檢測 CNV是人類遺傳變異的重要來源,與大量的人類疾病密切相關。dPCR能夠檢測拷貝數變異,檢測限低至1個拷貝?；谖⒖椎膁PCR已經被用于檢測生殖系核質體中的線粒體DNA (mtDNA)拷貝數。此外,一種稱為“局部臨時負壓輔助微流控裝置”的自制裝置已被證明可量化A549肺癌細胞系中角蛋白19的數量,并且觀察到熒光斑點的數量與稀釋因子之間存在良好的相關性[17]。在肺癌研究中,PENDER等[18]和LIN等[19]分別通過dPCR成功檢測到了KRAS基因突變和EGFR基因的拷貝數。KRAS基因突變的檢測限為2 000∶1(在2 000個野生KRAS基因中檢測到一個KRAS基因突變),靈敏度高于Sanger測序(10∶1)和下一代測序(50∶1)。除了肺癌,在高級別漿液性卵巢癌(HGSOC)的檢測中,HGSOC組織中缺失的NF1缺失和突變型TP53 p.R175H的數量已經被成功定量[20]。基于ddPCR技術檢測融合基因轉錄本的方法可對外泌體中的微量PML-RARA轉錄本進行絕對定量,為無創(chuàng)動態(tài)監(jiān)測急性早幼粒細胞白血病患者血清外泌體中PML-RARA融合基因的表達水平提供了可能[21]。總之,關于基因拷貝數變異或突變的檢測目前已在dPCR領域引起廣泛研究興趣,并逐漸成為dPCR應用的一大主流領域。

3.3miRNA表達分析 在癌癥的液體活檢中,miRNA被認為是一種很有價值的循環(huán)生物標志物,可用于癌癥的早期診斷[22]。其中,ddPCR因其高特異度和高靈敏度,已成為一種快速而準確的癌癥早期診斷方法。microwell-based dPCR (Thermo Fisher Scientific?)已被用于檢測肺癌,檢測5種miRNA生物標志物(miR16-5p、miR-21-5p、miR-126-3p、miR-486-5p和miR-600-5p)在肺癌患者血漿、細胞裂解液和組織中的拷貝數[23]。也有研究使用ddPCR進行急性早幼粒細胞白血病的檢測,在低濃度的靶基因下仍然表現出良好的批間和批內重復性[24]。在癌癥研究中的其他應用包括幫助乳腺癌患者血清中miRNAs的診斷[25]、分析直腸癌患者血漿中miR-155和miR-99b的表達情況[26]等。以上說明,ddPCR有望成為一種高特異度、高靈敏度、低成本且便捷的癌癥檢測方法。

3.4新一代測序驗證 二代測序是一種高通量的測序技術,它通過引入可逆終止末端,捕捉DNA復制過程中新添加堿基攜帶的特殊標記來確定DNA序列。不同于傳統(tǒng)的qPCR,dPCR精確的結果定量不依賴于不同的擴增子長度,為高通量測序提供了靈敏度和絕對校準。該方法成功地減少了1 000倍以上的標本量,且由于不需要預先放大,可以最大限度地減少偏差的不良影響。EIBLWIESER等[27]使用多重ddPCR預先擴增患者特異性的EWS融合基因,然后再采用Ion S5系統(tǒng)對該文庫進行測序,得出基于多重dPCR的靶向富集與NGS的組合提高了鑒定基因組融合序列成功率的結論。

此外,微流控液滴富集序列分析(MESA)是一種新的基于dPCR的目標富集技術。MESA技術可以將來自5個不同基因組位點的250 kb定向基因組DNA富集至31.6倍[28],然后提取基因組DNA片段進行基于TaqMan探針的微滴式dPCR,TaqMan陽性液滴經介電電泳法回收,然后通過酶促反應去除擴增子后進行測序。該方法僅需要少量的DNA就能全面識別目標位點內的遺傳多態(tài)性,非常適合生物醫(yī)學領域的遺傳變異研究。

3.5單細胞基因表達分析 由于不需要預擴增,dPCR可以在不存在擴增偏移的情況下進行單細胞基因表達分析,這凸顯了它替代傳統(tǒng)qPCR的潛力,能夠對細胞發(fā)育機制進行更深入的研究。例如,在一項對單細胞轉錄組的研究中,使用條形碼引物對微珠進行修飾,每個與微珠結合的單細胞被封裝在油包水的小滴中[29]。甲基化單細胞限制分析(SCRAM) 已經用于分析單細胞多位點甲基化水平。SCRAM主要包括以下步驟:單細胞的分離和裂解,甲基化敏感限制性內切酶對基因組DNA的消化作用,兩個周期的多位點PCR擴增,目標甲基化狀態(tài)的確定[30]。Westbrook的團隊總結了產生高通量單細胞的微納米技術,并為在單細胞基因表達分析中使用dPCR奠定了基礎[31]。dPCR在單細胞基因表達分析中的應用引起了研究者們的廣泛興趣。

3.6染色體異常分析 染色體異常是指染色體某一片段的缺失、添加或不規(guī)則變化。傳統(tǒng)的產前診斷方法如侵入性羊膜穿刺、絨毛膜取樣等可能會造成胎兒丟失。無創(chuàng)產前篩查(NIPS)或通過dPCR檢測胎兒的染色體異常對胎兒的影響較小,檢測更加準確,已成為目前新的診斷方法。2012年,BARRETT等[32]借助dPCR對孕婦血漿中的無細胞胎兒DNA(cffDNA)進行了鐮狀紅細胞貧血檢測。TAN等[33]采用鎖核酸(LNA)探針的多重 ddPCR 檢測準確地識別了胎兒非整倍體,證明了多重dPCR在非侵入性產前診斷中應用的可行性,是具有重要應用潛能的產前診斷方法。在胎兒染色體的21-三體、18-三體、13-三體檢測中,使用dPCR-NIPT檢測技術能夠在細胞游離DNA(cfDNA)分數低至5%、提取的cfDNA濃度低至0.2 ng/μL的情況下檢測出三體瘤[34]。在283份臨床標本檢測中,dPCR-NIPT測定顯示檢測靈敏度為100.00%,特異度為95.12%,優(yōu)于現有的方法。在胎兒的非整倍體染色體診斷中,JACKY等[35]提出了一種虛擬分區(qū)ddPCR分析方法,該方法根據熒光強度劃分多個閾值,以確定每個陽性液滴中目標基因的數量。這種算法減少了分區(qū)誤差,從而提高了基于復用ddPCR進行三體細胞鑒定的準確性。

dPCR還可以準確反映標本中的Y染色體微缺失狀況,優(yōu)化后的dPCR方法檢測標本的濃度可低至0.1 mg/L,該值遠低于常規(guī)qPCR的檢測限(1 mg/L),可開發(fā)成為男性不育癥及其他生殖診斷中的重要技術[36]。

4 展 望

目前,dPCR 在病原體鑒定和病原微生物的定量檢測上具有突出優(yōu)勢:臨床標本無須經過病原微生物培養(yǎng)過程即可進行高靈敏度的檢測,縮短了報告周期,且可以從多種高濃度的背景核酸中檢出病原微生物,使快速檢測潛在的病原微生物成為可能,對于感染性疾病的診斷和控制具有重大意義。此外,dPCR在腫瘤領域的應用也正在不斷被拓寬,它適用于檢測各種體液標本中的腫瘤相關突變,可輔助分析患者的腫瘤突變,能夠部分克服腫瘤的異質性;此外,dPCR可以從分子表型層面發(fā)現腫瘤的早期耐藥突變,從而提示醫(yī)生耐藥出現的可能性,幫助調整用藥方案。同時,dPCR能大幅降低體細胞中背景DNA的干擾,實現對腫瘤標志物的有效檢測,還能定量監(jiān)測突變頻率變化,量化檢測標準。目前dPCR技術已經成功應用于EGFR、KARS、BRAF、PIK3CA等各種癌基因突變檢測,以及癌癥相關基因(如HER2基因)的擴增檢測。相比于NGS,dPCR對實驗室人員和設施的要求低,操作流程簡易,報告時間快速,便于臨床實驗室工作的開展。

同時,dPCR也面臨一些挑戰(zhàn),包括檢測下限受限、動態(tài)范圍小、RNA PCR中目標逆轉錄不完整導致檢測不到所有的拷貝等。cdPCR成本高、通量低的問題也對其提出了挑戰(zhàn)。在檢測低拷貝數標本時,ddPCR較不穩(wěn)定,需要重復檢測以獲得合格的數據。dPCR臨床檢測還沒有統(tǒng)一的行業(yè)標準,缺乏商品化的室內質控品,同時由于靈敏度較高,檢測過程中容易遭受外源污染,因此需要做好實驗室內部質量控制,建立規(guī)范、標準的檢測操作流程和結果評估分析體,加強人員培訓,在大量比對和驗證實驗的基礎上才能夠進入臨床實驗室。