閆清華,李寧寧,張文博,王佳欣,王歌

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003）

癌癥是最普遍的疾病之一,根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）目前的統(tǒng)計結(jié)果來看,每五人一生中就有一人罹患癌癥,而40%的癌癥可以通過有效的預(yù)防措施得以避免,并且可以通過早期發(fā)現(xiàn)腫瘤來降低死亡率.由于癌細(xì)胞具有很強的移動性和侵襲性,在腫瘤被診斷出來很久之前就可以進入循環(huán)系統(tǒng),因此為成功管理和控制癌癥疾病,診斷和測量癌癥的進展至關(guān)重要.由于癌細(xì)胞基因組變化與疾病過程的獨特關(guān)聯(lián)性,因此腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用在癌癥診斷中起著關(guān)鍵作用.腫瘤標(biāo)志物是一種能夠反映腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志物,主要發(fā)生于癌癥產(chǎn)生期間,始發(fā)于腫瘤細(xì)胞,也可以是由宿主對腫瘤刺激而產(chǎn)生的一類能夠被監(jiān)測到的物質(zhì).生物標(biāo)志物[1-4]獲得途徑比較簡單,其通過體液就能獲得,如血液樣本（包括血清和血漿）、胃液、唾液、尿液、糞便等,腫瘤標(biāo)志物在腫瘤發(fā)病期間的表達量變化有助于對腫瘤進行早期預(yù)測.已有腫瘤標(biāo)志物的檢測方法主要有酶標(biāo)記免疫分析法、免疫發(fā)光分析法、放射免疫分析法以及生物傳感器法,生物傳感器作為一種電化學(xué)檢測方法,因其簡便的制備方法和高效的檢測效率聞名.

生物傳感器[5-8]是一種由生物元件組成的固態(tài)表面的設(shè)備,它可以與分析物進行生物特異性相互作用,并且傳感器可以傳導(dǎo)信號.生物傳感器分類之一的免疫傳感器,其生物元件是抗體或Ab 片段,利用抗原抗體特異結(jié)合作用形成免疫復(fù)合物這一原理,首先將抗體固定在納米制備的載體上,材料之間可以通過化學(xué)鍵或相互作用進行連接,基于理化換能和信號放大原理將生物的信號轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蜃R別的電信號,用于檢測待測標(biāo)志物.該傳感器檢測快速、結(jié)果靈敏、準(zhǔn)確度高,受到諸多科研者的研究和關(guān)注.

近年來的研究表明,納米材料、納米顆粒和導(dǎo)電聚合物在免疫傳感器制造中的應(yīng)用,使納米生物傳感器平臺具有簡單、靈敏、快速和特異的特點.由于納米材料具備好的生物相容性、大的比表面積、能夠通過化學(xué)鍵與抗原（抗體）進行結(jié)合等優(yōu)點,因此其成為抗體結(jié)合載體的良好選擇.納米材料CoMOFs 具有很多孔隙和褶皺,可以通過Au-NH2結(jié)合更多的Au,Cu 是一種比較常見的化學(xué)物質(zhì),能夠調(diào)節(jié)傳感器的化學(xué)性能,在合成的納米材料CoMOFs/CuAu 中,有大量的Au 均勻地附著在CoMOFs 上,這樣使得合成的CoMOFs/CuAu 具有比其他物質(zhì)更大的比表面積、更好的生物相容性等結(jié)合抗體的優(yōu)勢.CoMOFs/CuAu的制作比較簡單方便,能夠增加與抗體的結(jié)合量,進而使抗原抗體更好地發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng),由離子還原成的金屬Au 導(dǎo)電性比較好,能夠增大傳感器表面的電子傳遞速率,從而放大傳感器的檢測電流信號.用CoMOFs/CuAu 作為基底制作的免疫傳感器具有制作方法簡便、檢測速度更快、靈敏度更高的特點.

本研究將納米材料CoMOFs 與CuAu 結(jié)合,既可以得到分散性良好的納米復(fù)合材料CoMOFs/CuAu,又可以通過金氨鍵（Au-NH2）連接大量生物分子,將該復(fù)合材料用作電極的基底材料,加上抗原- 抗體特異性結(jié)合的特性從而實現(xiàn)對腫瘤標(biāo)志物的捕獲, 材料間相互結(jié)合制備成一種檢測CA72-4 的免疫傳感器.利用CV、DPV、EIS 等方法對其進行表征檢測,實現(xiàn)對目標(biāo)物的高靈敏檢測,以期為臨床應(yīng)用研究提供試驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

氯化銅（CuCl2）、抗壞血酸（AA）、2- 氨基對苯二甲酸（NH2-BDC）、N、N- 二甲基甲酰胺（DMF）、四氯金酸（HAuCl4·3H2O）、牛血清白蛋白（BSA）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、鐵氰化鉀（K3[Fe（CN）6]）、亞鐵氰化鉀（K4[Fe（CN）6]）、尿酸（UA）、硝酸（HNO3）、硫酸（H2SO4）、無水乙醇（C2H6O）均購于上海麥克林生化科技有限公司.CA72-4,anti-CA72-4 購于上海新潮科技有限公司.

760C 電化學(xué)工作站, 上海辰華儀器公司；SB-100D 超聲波清洗器, 新芝生物科技有限公司；85-2A磁力攪拌器、DZF6020 真空干燥箱均,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FE28 型pH 計,梅特勒- 托利多有限公司；CP225D 電子天平,德國賽多利斯集團.

1.2 電解液的配制

制備PBS 溶液：分別制備0.1 mol/L 磷酸氫二鈉和0.1 mol/L 磷酸二氫鈉,將其混合.

鐵氰化鉀溶液：制備5 mmol/L[Fe（CN）6]3-/4-和0.1 mol/L KCl,將其混合,緩慢搖動待全部溶解后避光放至50 mL 離心管中.

1.3 CoMOFs/CuAu 納米復(fù)合材料的制備

把8 mg 的NaBH4溶解在4 mL 超純冰水中,準(zhǔn)備好磁力攪拌器,在500 r/min 攪拌下倒入到30 mL超純冰水中,制備出含有2 mg 的CoMOFs,3.08 mg 的CuCl2,和180 μL 的HAuCl4·3H2O（5%,w/v）的4 mL 溶液；將制備好的NaBH4溶液與該溶液進行混合,在室溫條件下用磁力攪拌器使其混合液充分反應(yīng)5 min；反應(yīng)結(jié)束后得到的納米復(fù)合材料溶液先用離心機進行離心,沉淀物質(zhì)用超純水離心洗滌2 次；用封口膜封住管口,使其在真空干燥箱37 ℃條件下干燥過夜,制備出CoMOFs/CuAu.

1.4 電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建

將裸玻碳電極（GCE 電極）用超純水沖洗干凈后分別用粒徑為0.3 μm 和50 nm 的氧化鋁（Al2O3）粉末畫“8”字打磨拋光,正反順序各100 圈；再使用乙醇溶液、硝酸溶液和超純水分別超聲5 min；接著運用電化學(xué)工作站的循環(huán)伏安法使電極在硫酸中進行多次掃描,使其活化直到保持穩(wěn)定的狀態(tài)；之后再將電極在空氣中進行晾干,然后將10 μL 的CoMOFs/CuAu 納米復(fù)合材料溶液滴涂在清潔的GCE 上,電極干燥后用超純水輕輕洗去多余物質(zhì)或其他干擾物,再進行晾干；之后將5 μL 的抗體溶液滴涂在以上電化學(xué)傳感器表面,經(jīng)過一段時間,CoMOFs/CuAu 與抗體結(jié)合之后,再用PBS 輕輕洗去未結(jié)合的抗體或其他雜質(zhì),接著取6 μL 的BSA 試劑涂到電極上,BSA 試劑可以消除CoMOFs/CuAu 上的非特異性吸附,進而防止影響試驗的進行,經(jīng)過一段時間后用PBS 輕輕洗去多余物質(zhì)；再在其表面滴加稀釋后的5 μL 抗原溶液,晾干后,用PBS 洗去沒有結(jié)合的物質(zhì)或其他雜質(zhì),在37 ℃條件下干燥后,即制成了免疫傳感器Ag/BSA/Ab/CoMOFs/CuAu/GCE,放入冰箱中備用（圖1）.

圖1 免疫傳感器制備流程Fig.1 The fabrication process of electrochemical immunosensor

1.5 電化學(xué)免疫傳感器的檢測過程

各檢測過程均在含5 mmol/L[Fe（CN）6]3-/4-和0.1 mol/L KCl 的PBS 溶液中進行,各檢測過程采用三電極工作體系進行,參比電極為甘汞電極,對電極為鉑絲電極,工作電極為玻碳電極.利用循環(huán)伏安法、阻抗法和差分脈沖伏安法對其進行表征和檢測,CV 要求電壓為-0.4 V ～+0.8 V,掃描速率為0.1 V/s；EIS要求頻率范圍為0.1 ～100 000 Hz 和10 mV；DPV 在電壓范圍為0 V～0.6 V 和50 mV 的幅度下進行.將制備的Ag/BSA/Ab/CoMOFs/CuAu/GCE 電極作為工作電極在上述條件下進行一系列電化學(xué)檢測.

2 結(jié)果與分析

2.1 納米材料CoMOFs、CoMOFs/CuAu 的表征

制備的CoMOFs 和CoMOFs/CuAu 納米材料分別用掃描電鏡和透射電鏡進行表征,由圖2-a 和圖2-b 可知,CoMOFs 具有很多孔隙和褶皺,含有較大的比表面積,在合成的CoMOFs/CuAu 中,有Au 附著其上可增大電子傳遞速率,而Cu 可以調(diào)整傳感器的性能.用透射電鏡對CoMOFs 和CoMOFs/CuAu 的形貌進行表征,由圖2-c 和圖2-d 可見更多的Au 附著在CoMOFs 上,而它的分布也比較均勻,Au 能夠與-NH2 共價結(jié)合,從而使抗體更好地結(jié)合,這樣能夠提高傳感器的穩(wěn)定性和導(dǎo)電性,以及更好地檢測出傳感器電流信號的變化.

圖2 納米材料CoMOFs、CoMOFs/CuAu 的掃描電鏡和透射電鏡圖Fig.2 SEMand TEMimage of CoMOFs、CoMOFs/CuAu

2.2 電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建過程表征

為了對試驗過程中電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建過程進行表征,使用CV 法對各孵育步驟之后的修飾電極的傳感界面性質(zhì)進行測量.結(jié)果如圖3-a 所示,曲線a 是未作修飾的裸電極的CV 結(jié)果,可以觀察到一對明顯的可逆氧化還原峰；曲線b 顯示了CoMOFs/CuAu 修飾電極的結(jié)果,由于材料的導(dǎo)電性能較低致使氧化還原峰的電流下降；接著,滴涂的抗體通過氨基與復(fù)合材料結(jié)合修飾到電極上,由于抗體是大分子蛋白質(zhì),會阻礙電子傳遞,使得電極表面的電阻進一步增加,所以降低了氧化還原峰電流（曲線c）；同樣地,當(dāng)用BSA 封閉Ab/CoMOFs/CuAu/GCE 的非特異性位點時,由于大分子蛋白質(zhì)阻礙了電子傳遞,峰電流值會進一步降低（曲線d）；最后,由于抗原- 抗體特異性結(jié)合生成的免疫復(fù)合物會產(chǎn)生高電阻阻礙電子傳遞,因此抗原蛋白CA72-4 和抗體結(jié)合后峰值電流降低到最小值（曲線e）.

圖3 電極修飾過程的電化學(xué)表征圖Fig.3 Electrochemical characterization diagram of electrode modification process

為進一步驗證上述試驗結(jié)果,運用EIS 法作出了電化學(xué)阻抗譜的奈奎斯特（Nyquist）圖,如圖3-b 所示,很容易看出,CoMOFs/CuAu 修飾電極（曲線b）的EIS 與裸GCE（曲線a）相比阻抗略微增大；抗體被修飾以后可以看到阻抗明顯增大（曲線c）,由于抗體由生物大分子組成,會阻擋電極表面?zhèn)鬟f電子；BSA 主要是將非特異性的結(jié)合位點封閉,阻抗依然增大（曲線d）；最后抗原特異性結(jié)合抗體,進一步阻礙電子傳遞,阻抗也進一步增大（曲線e）.由EIS 圖像與CV 圖結(jié)果來看,二者相互印證,因此證明了免疫傳感器的每一個制備過程都是成功的.

2.3 電化學(xué)免疫傳感器掃速的優(yōu)化

為驗證免疫傳感器表面的電化學(xué)控制過程,我們將免疫傳感器在含有5 mmol/L[Fe（CN）6]3-/4-和0.1 mmol/L KCl 的PBS 溶液中做了不同掃描速率的CV 表征,結(jié)果如圖4-a 所示.由圖4-b 可以看出傳感器掃描圖像具有明顯的氧化還原峰,且隨著掃速增大,氧化還原峰增大.圖4-b 顯示的是氧化還原峰電流與掃描速率平方根的線性關(guān)系,線性關(guān)系分別為y=1.57x+37.34 和y=-1.42x-34.00,相關(guān)系數(shù)均為0.99.證明該傳感器在溶液中是由擴散控制的.

2.4 免疫傳感器檢測條件的優(yōu)化

電化學(xué)試驗容易受到多種條件影響,為使電化學(xué)檢測性能穩(wěn)定,檢測結(jié)果可靠,我們對抗原孵育時間、檢測溶液pH 等試驗條件進行優(yōu)化.

抗原抗體結(jié)合是試驗中最為關(guān)鍵的步驟,若孵育時間過短,抗原抗體結(jié)合形成的免疫復(fù)合物量就會過少,檢測的準(zhǔn)確性就會大大降低.如圖5-a 所示,隨著孵育時間增加,傳感器響應(yīng)電流空白電極和結(jié)合之后電流差值逐漸增大,在40 min 之后電流變化量趨于平穩(wěn),這表明在40 min 之后抗原抗體結(jié)合量達到最大值,電極捕獲抗原能力達到最大值,所以我們選定40 min 為最佳孵育時間.

圖5 免疫傳感器檢測條件的優(yōu)化Fig.5 Optimization of the experimental conditions for the immunosensor

由于電極捕獲的大分子物質(zhì)為活性蛋白,其化學(xué)性質(zhì)受電解液pH 影響,這是因為在高酸或高堿環(huán)境中復(fù)合材料催化能力減弱,同時大分子活性材料的活性會下降.我們設(shè)置不同pH 梯度的鐵氰化鉀溶液,用于檢測傳感器性能.如圖5-b 所示,隨著pH 逐漸變化,電流的響應(yīng)量是先升高然后再降低,pH 為6.5 時響應(yīng)電流最高,因此試驗的最適pH 為6.5.

2.5 電化學(xué)免疫傳感器的性能分析

2.5.1 檢測范圍和檢測限在最優(yōu)試驗條件下,用DPV 法在鐵氰化鉀溶液中測定不同濃度的糖蛋白抗原72-4 在免疫傳感器上的電流響應(yīng),試驗結(jié)果如圖6 所示,圖6-a 可以看出隨著抗原濃度升高,峰電流值下降；在圖6-b 中,空白電極和修飾抗原后的DPV 電流差值隨抗原濃度的增大而增加,在0.001 ～100 μmol/min·mL的范圍內(nèi),空白電極和孵育抗原之后的免疫電極的DPV 的峰電流差與抗原濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系,其線性方程為：△I（μA）=3.44（lg[C]+76.79（R2=0.99）,根據(jù)計算公式3σ/b（σ 為空白電極響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差,b 為響應(yīng)方程的斜率）計算得出最低檢測限為：0.007 μmol/min·mL（S/N=3）.

圖6 免疫傳感器的檢測范圍測定Fig.6 Determination of detection range of immunosensors

對比其他文獻資料如表1 所示,該研究制備的免疫傳感器具有較寬的檢測范圍和較低的檢出限.這主要是由于CoMOFs 較大的比表面積為CuAu 提供了更多的結(jié)合位點,使得后者結(jié)合抗體能力更強,更易于抗原抗體免疫復(fù)合物的形成,即使?jié)舛容^低的抗原也能被捕獲.該免疫傳感器成本很低、方便制備,操作簡單,發(fā)展前景很大.

表1 本試驗構(gòu)建的傳感器線性范圍和檢測限與其他檢測方法的對比Tab.1 Comparison of the linear range and the limit of detection of other immunosensors

2.5.2 選擇性、重復(fù)性和穩(wěn)定性選擇性是傳感器性能分析的關(guān)鍵因素之一,目的是為了排除非特異性蛋白相互作用的DPV 響應(yīng).試驗中在優(yōu)化的條件下檢測了有可能作為干擾因素的目標(biāo)物體系,如抗壞血酸、L- 半胱氨酸、尿酸、CEA 等.如圖7-a 所示（展示了空白電極、CEA、抗壞血酸、L- 半胱氨酸、尿酸及幾種干擾物質(zhì)的混合溶液所測得的電化學(xué)信號）.所有干擾物的濃度均為10 ng/mL,CA72-4 的濃度為1 μmol/min·mL.結(jié)果可以看出,無目標(biāo)物溶液中的DPV 響應(yīng)信號明顯低于含目標(biāo)物CA72-4.另外測定干擾成分與目標(biāo)物混合的溶液,響應(yīng)信號未明顯下降.這表明了該免疫傳感器選擇性能十分良好.

圖7 免疫傳感器的性能檢測Fig.6 Performance testing of immunosensors

制備多支免疫傳感器評價其重復(fù)性.如圖7-b 所示,對1 μmol/min·mL的CA72-4 的檢測結(jié)果進行批內(nèi)和批間的測定,測定結(jié)果顯示幾次結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD=3.82%）均不超過5%,表明制備的免疫電極具有良好的重復(fù)性.

將組裝好的免疫電極放在4 ℃冰箱中保存,在存放后的第4、8、12 天分別對其DPV 響應(yīng)電流進行檢測,結(jié)果如圖7-c 所示,12 d 以后電流響應(yīng)變化的計算結(jié)果變化的標(biāo)準(zhǔn)差為3.8%.以上結(jié)果表明,該免疫傳感器的穩(wěn)定性是可以被接受的.

2.6 實際樣品的檢測

為了檢測所制備的免疫傳感器在臨床應(yīng)用中的價值,用人血清作為樣本,用制備的免疫傳感器檢測其中含有的CA72-4 濃度,試驗結(jié)果如表2 所示.然后取三份樣品,分別加入標(biāo)準(zhǔn)濃度為5 μmol/min·mL、10 μmol/min·mL、20 μmol/min·mL的抗原,經(jīng)免疫傳感器檢測后用得到的結(jié)果計算加標(biāo)回收率.如表2所示,免疫傳感器的加標(biāo)回收率在100.3%～106.6%之間,RSD 在2.36%～4.17%之間.

表2 傳感器測定樣品中CA72-4 的回收率（N=3）Tab.2 Determination of CA72-4 in real samples（N=3）

3 結(jié)論

本論文以CoMOFs/CuAu 為電極基底層,構(gòu)建了一種簡單的電化學(xué)免疫傳感器.CoMOFs/CuAu 可以提高GCE 比表面積和生物相容性,為抗體的固定化提供了大量的官能團,進一步改善了修飾電極的電化學(xué)性能,具有捕獲抗原能力強、靈敏度高的優(yōu)勢.經(jīng)檢測的試驗結(jié)果顯示該CA72-4 電化學(xué)免疫傳感器的線性響應(yīng)范圍為0.001～100 μmol/min·mL,檢測限為0.007 μmol/min·mL（S/N=3）,且具有較好的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性.該免疫傳感器為臨床標(biāo)本中生物標(biāo)志物的敏感分析提供了一個很有前景的平臺,對疾病的早期識別、治療和預(yù)后監(jiān)測具有重要意義.