路書山,劉 浩,趙燕洲,屠繼軍,曹 慧①

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095;2.安徽省宣城市宣州區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,安徽 宣城 242099)

中國是農(nóng)業(yè)大國,在生產(chǎn)中通常使用化肥來提高作物產(chǎn)量,但化肥使用強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)[1-2]。長期不合理的化肥使用會(huì)導(dǎo)致土壤板結(jié)、養(yǎng)分失調(diào)、病蟲害加劇和環(huán)境污染問題[3-4],進(jìn)而危害人畜健康,不利于農(nóng)業(yè)高質(zhì)高效生產(chǎn)。菜粕和豆粕作為植物油加工副產(chǎn)品,粗蛋白和氨基酸含量豐富,通常被作為飼料或肥料的原料,但硫苷、單寧和植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在,使其利用率大大降低[5]。目前,已有多種提高菜籽粕或豆粕利用率的研究。王永紅等[6]利用產(chǎn)蛋白酶菌株嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(StenotrophomonasmaltrophiliaG12,FJ211222)和短小芽孢桿菌(BacilluspumilusK11,FJ211221)混合菌種固體發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸肥料,發(fā)酵過程參數(shù)優(yōu)化后的菜粕蛋白水解度達(dá)到13.1%,增加了游離氨基酸和小肽含量。LIU等[7]利用蛋白酶產(chǎn)生菌BacillusflexusNJNPD41作為菌種材料,顯著提高了菜籽粕固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的游離氨基酸和短肽量。WANG等[8]利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌株,通過固態(tài)發(fā)酵將豆粕蛋白水解成水溶性低相對(duì)分子質(zhì)量產(chǎn)物,產(chǎn)物富含多肽和游離氨基酸,以此發(fā)酵產(chǎn)物作為肥料,在低濃度(ρ=2.5 g·L-1)條件下其對(duì)油菜生長有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。

通過施用肥料改善土壤肥力和提高作物品質(zhì)是施肥的最主要目的[9-10]。目前,主要研究的肥料有微生物肥料、復(fù)合肥以及有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥料等。微生物肥料能通過微生物的生命活動(dòng)促進(jìn)植物生長,改良土壤性狀,但微生物肥料存在肥效慢、專性強(qiáng)和貯存期短等問題[11]。復(fù)合肥營養(yǎng)元素多,養(yǎng)分含量高,但養(yǎng)分比例固定,難以滿足各類土壤和各種作物的需要,對(duì)施肥時(shí)間和施肥位置要求較高[12]。有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥料含有有機(jī)物質(zhì)和無機(jī)營養(yǎng),肥料中有機(jī)部分的肥效和微生物作用較低,肥效主要是無機(jī)化肥的作用[13-14]。氨基酸水溶肥是一類以氨基酸為主體的水溶性肥料,對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大意義[15]。大量研究表明,植物能夠吸收有機(jī)氮[16-17],而氨基酸作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的最小分子,植物可以通過根系和葉片吸收這種有機(jī)氮肥[18]。施用氨基酸水溶肥還可以減緩?fù)寥浪峄俣萚19-20],提升土壤有機(jī)質(zhì)的分解和肥料的轉(zhuǎn)化,進(jìn)一步提升農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì),最終改善土壤質(zhì)量[21-22]。

筆者試驗(yàn)探究了各種發(fā)酵因素對(duì)氨基酸產(chǎn)出的影響,為氨基酸水溶肥的生產(chǎn)提供了重要的理論依據(jù)。盡管發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的應(yīng)用已有很多,但針對(duì)不同應(yīng)用場(chǎng)景該工藝仍需進(jìn)行改進(jìn),以提高生產(chǎn)率和降低生產(chǎn)成本。通過Plackett-Burman試驗(yàn)、爬坡試驗(yàn)以及Box-Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)[23]并優(yōu)化菜粕和豆粕混合生產(chǎn)氨基酸水溶肥的發(fā)酵工藝,不僅可以減輕污染問題,還可以改善土壤環(huán)境,提高作物品質(zhì),提升農(nóng)業(yè)廢棄物附加值。這對(duì)推動(dòng)氨基酸肥料的發(fā)展與應(yīng)用,以及促進(jìn)農(nóng)業(yè)的高質(zhì)、高效和可持續(xù)發(fā)展等都具有重要意義[24]。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

植物乳桿菌:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室保藏菌株LactobacillusplantarumG71;酵母菌:安琪酵母股份有限公司生產(chǎn),物料號(hào)為12004236;枯草芽孢桿菌:河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司生產(chǎn),登記號(hào)為PD20150091。

1.2 酶

堿性蛋白水解酶(50 U·mg-1)和酸性蛋白水解酶(100 U·mg-1)均為上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(g·L-1):蛋白胨10 g,酵母膏5 g,牛肉膏10 g,葡萄糖20 g,磷酸氫二鉀2 g,醋酸鈉5 g,檸檬酸三銨2 g,硫酸鎂0.1 g,硫酸錳0.05 g,吐溫-80 1 g;LB培養(yǎng)基(g·L-1):蛋白胨10 g,酵母膏5 g,氯化鈉10 g;YPD培養(yǎng)基(g·L-1):蛋白胨20 g,酵母膏10 g,葡萄糖20 g。

1.4 種子液的制備

在250 mL錐形瓶中分裝100 mL上述液體培養(yǎng)基,滅菌后將活化菌種轉(zhuǎn)接到對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基中。之后將接種過的MRS培養(yǎng)基(植物乳桿菌)置于37 ℃ 培養(yǎng)箱中,將YPD培養(yǎng)基(酵母菌)置于30 ℃、180 r·min-1搖床中,將LB培養(yǎng)基(枯草芽孢桿菌)置于37 ℃、180 r·min-1搖床中,分別培養(yǎng)24 h,將3個(gè)菌株在培養(yǎng)皿中劃線培養(yǎng)獲取單菌落,之后挑取單菌落轉(zhuǎn)移至100 mL液體培養(yǎng)基中,恒溫培養(yǎng)24 h制成種子液,用于菌種發(fā)酵培養(yǎng)。

1.5 菌種發(fā)酵培養(yǎng)液的制備

將上述種子液接種于相對(duì)應(yīng)的100 mL液體培養(yǎng)基中,接種量為1%,繼續(xù)按照上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)24 h,即得到用于發(fā)酵優(yōu)化使用的單菌發(fā)酵培養(yǎng)液。

1.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

明確3種菌株的添加比例對(duì)發(fā)酵菜粕、豆粕混合物指標(biāo)的影響,以游離氨基酸增加率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。菌株設(shè)置3個(gè)添加水平,設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn),試驗(yàn)各因素水平設(shè)置為植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和安琪酵母接種量分別為1%、5%和10%。

1.7 發(fā)酵步驟

取7 g菜粕、3 g豆粕和0.01 g堿性蛋白酶裝入100 mL錐形瓶中,各菌種培養(yǎng)液接種比例為1∶1∶1,無菌水按試驗(yàn)設(shè)定的比例接入到發(fā)酵底物中,攪拌均勻,在25 ℃條件下恒溫靜置發(fā)酵,每隔一定時(shí)間進(jìn)行翻料,培養(yǎng)期間每隔12 h用pH計(jì)測(cè)定pH,當(dāng)pH<5時(shí)加入0.01 g酸性蛋白酶。接種量與料水比的計(jì)算:接種量按菌種發(fā)酵培養(yǎng)液體積與發(fā)酵底物的質(zhì)量比計(jì)算,料水比按發(fā)酵底物質(zhì)量與去離子水體積比計(jì)算。

1.8 pH調(diào)節(jié)與測(cè)定方法

將發(fā)酵培養(yǎng)基于搖床中在180 r·min-1、35 ℃條件下混合30 min,取出后靜置30 s,然后測(cè)定其pH。試驗(yàn)時(shí)使用0.5 mol·L-1NaOH和0.5 mol·L-1HCl逐滴添加,然后用相同方式檢測(cè)是否調(diào)節(jié)至預(yù)定值。

1.9 發(fā)酵產(chǎn)物的提取與測(cè)定方法

將發(fā)酵產(chǎn)物置于搖床中在150 r·min-1、35 ℃條件下提取30 min。提取結(jié)束后將錐形瓶內(nèi)所有固液成分移入50 mL離心管中,放入離心機(jī)并調(diào)整轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1,4 ℃條件下離心30 min。離心結(jié)束后將上清液移入1 000 mL容量瓶中,將殘?jiān)迫脲F形瓶中加入30 mL蒸餾水繼續(xù)提取。重復(fù)上述步驟3次,將容量瓶定容至1 000 mL。用茚三酮比色法測(cè)定游離氨基酸含量后計(jì)算每克物料所生產(chǎn)的游離氨基酸質(zhì)量。

1.10 氨基酸水溶肥各成分的提取與測(cè)定

將發(fā)酵產(chǎn)物置于搖床中在150 r·min-1、35 ℃條件下提取30 min。提取結(jié)束后將錐形瓶內(nèi)所有液體及殘?jiān)迫?0 mL離心管中,放入離心機(jī)并調(diào)整轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1,4 ℃條件下離心30 min。用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀和總氮分析儀測(cè)定其中的大量元素和中微量元素含量。

1.11 Plackett-Burman試驗(yàn)分析

采用PB(Plackett-Burman)試驗(yàn),分析發(fā)酵時(shí)間(A)、起始pH(B)、料水比(C)、接種量(D)和翻料間隔(E)對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)游離氨基酸的影響。上述5個(gè)影響因子分別取高和低2個(gè)水平,以發(fā)酵液中游離氨基酸含量作為因變量,采用Minitab 17軟件設(shè)計(jì)12組試驗(yàn)。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),各因素的高低水平如下:培養(yǎng)時(shí)間,120、216 h;起始pH,6、9;料水比,1∶3、1∶7;接種量,3%、7%;翻料間隔,12、24 h。

1.12 最陡爬坡試驗(yàn)分析

根據(jù)1.11節(jié)所述通過PB試驗(yàn)結(jié)果篩選出3個(gè)顯著影響因子,參考各個(gè)顯著因子的正負(fù)效應(yīng)值并結(jié)合實(shí)際情況,確定最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方向及步長。以最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果的最大游離氨基酸含量,作為下一步Box-Behnken Design(BBD)試驗(yàn)分析的中心點(diǎn)。

1.13 BBD試驗(yàn)

采用Expert Design 8.1軟件對(duì)3個(gè)因素進(jìn)行BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì),制作其對(duì)游離氨基酸含量影響的響應(yīng)面曲線。BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各因素設(shè)置及水平如下:發(fā)酵時(shí)間,192、216、240 h;起始pH,8、9、10;料水比,1∶6、1∶7、1∶8。

1.14 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0中單因素分析比較平均值,結(jié)合 Duncan、LSD和S-N-K等方法進(jìn)行多重比較,以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株接種量對(duì)氨基酸含量的影響

對(duì)以氨基酸含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)的正交結(jié)果進(jìn)行極差分析。由表1可知,3個(gè)菌株的最佳組合為植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌的培養(yǎng)液體積比為1∶1∶1。極差分析結(jié)果顯示,3株菌對(duì)氨基酸含量影響的大小順序?yàn)橹参锶闂U菌>枯草芽孢桿菌>酵母菌。正交試驗(yàn)結(jié)果包含該最佳組合,其游離氨基酸含量為36.4 g·kg-1,明顯高于其他處理。主體間效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 各菌株不同水平氨基酸含量方差分析

由表2可知,3株菌的不同添加比例對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有顯著影響(P<0.05)。對(duì)于植物乳桿菌1%接種量水平試驗(yàn)組氨基酸含量顯著高于5%和10%接種量水平(P<0.05);枯草芽孢桿菌1%接種量水平試驗(yàn)組氨基酸含量顯著高于5%接種量水平(P<0.05),但與10%接種量水平之間差異不顯著(P>0.05);酵母菌3個(gè)接種量水平試驗(yàn)組之間氨基酸含量差異不顯著(P>0.05)。

2.2 PB試驗(yàn)各因素的主要效應(yīng)分析

通過PB試驗(yàn)共得到12組結(jié)果,具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。PB試驗(yàn)回歸系數(shù)t檢驗(yàn)(表4)顯示,培養(yǎng)時(shí)間(A)、pH(B)和料水比(C)的t值分別為4.60、2.60和3.58,其P值分別為0.004、0.041和0.012,P值均小于0.05。因素D(接種量)和E(翻料間隔)回歸系數(shù)不為零的假設(shè)成立,且因素A、B和C對(duì)游離氨基酸產(chǎn)量有顯著影響。

表3 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)和游離氨基酸含量

表4 PB試驗(yàn)回歸系數(shù)

為明確各因素對(duì)于固體發(fā)酵的影響程度,制作標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto圖,結(jié)果見圖1。由圖1可知,各因素對(duì)于游離氨基酸產(chǎn)量均產(chǎn)生影響,影響程度大小依次為A>C>B>D>E,其中,A、B和C對(duì)于固體發(fā)酵有顯著影響。因此,認(rèn)為A、B和C是影響水溶性氨基酸含量的主要因素,后期試驗(yàn)選取這3個(gè)因素進(jìn)行。

A為培養(yǎng)時(shí)間,B為pH,C為料水比,D為接種量,E為翻料間隔。虛線為顯著性參考線。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)分析

通過PB試驗(yàn)篩選出A、B和C3個(gè)具有顯著性影響的因子,但還需要通過PB試驗(yàn)擬合方程系數(shù)的正負(fù)值來確定最陡爬坡試驗(yàn)的方向和步長,從而設(shè)計(jì)爬坡試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表5,最大游離氨基酸含量出現(xiàn)在第4組,表明此時(shí)A、B和C水平接近最優(yōu)點(diǎn),故選取此水平(培養(yǎng)時(shí)間為216 h,起始pH為9.0,料水比為1∶7)作為后續(xù)BBD試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

2.4 BBD試驗(yàn)結(jié)果分析

利用Expert Design進(jìn)行BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì),共得到17組結(jié)果,具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表6。通過對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到響應(yīng)值(氨基酸產(chǎn)量)對(duì)影響發(fā)酵反應(yīng)的關(guān)鍵因素(A、B和C)的多元二次回歸方程:R1(氨基酸產(chǎn)量)=2.55+0.026×A+0.017×B+7.625E-00×C+0.010×A×B+4.000E-003×A×C+4.250E-003×B×C-0.19×A2-0.078×B2-0.052×C2。模型顯示差異達(dá)極顯著水平(P<0.01),表明用回歸方程描述各因素與因變量之間的關(guān)系時(shí),因變量與各因素之間的關(guān)系顯著,說明該模型可靠。而失擬項(xiàng)未達(dá)顯著水平(P=0.313 9),表明該方程的擬合度和可信度都很高,可用于預(yù)測(cè)該發(fā)酵試驗(yàn)的最大游離氨基酸產(chǎn)量(表7)。

表6 BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

表7 BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析

響應(yīng)面立體分析結(jié)果(圖2)表明,各因素間交互作用對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)游離氨基酸能力有影響,各因素水平存在游離氨基酸生產(chǎn)的最佳值。利用Expert Design 8.1軟件模擬計(jì)算最優(yōu)工藝參數(shù)可得,最大游離氨基酸的極值點(diǎn)編碼:發(fā)酵時(shí)間,217.68 h;起始pH,9.12;料水比,1∶7.008。該模型預(yù)測(cè)的游離氨基酸產(chǎn)量最優(yōu)結(jié)果可達(dá)76.4 g·kg-1。為了驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)氨基酸含量與實(shí)際氨基酸含量的擬合程度,采用優(yōu)化后的發(fā)酵工藝參數(shù)重復(fù)試驗(yàn)3次,所得平均游離氨基酸產(chǎn)量達(dá)到(76.8±1.5) g·kg-1。實(shí)際氨基酸含量與理論值較為接近,表明模型有效。

R1為氨基酸產(chǎn)量;A為發(fā)酵時(shí)間;B為起始pH;C為料水比。

2.5 發(fā)酵產(chǎn)物水溶物主要成分分析

發(fā)酵產(chǎn)物中氮、磷和鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.453%、0.098 8%和0.257%,中量元素(Ca+Mg+S)和微量元素(Fe+Mn+Zn+Cu+B)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.132%和0.002 43%。采用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)出17種氨基酸,苯丙氨酸(Phe)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,為0.106 8%,其后依次為精氨酸(Arg)和亮氨酸(Leu),其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.085 5%和0.081 3%(表8)。

表8 發(fā)酵產(chǎn)物水溶物主要成分分析

3 討論

不同發(fā)酵參數(shù)如pH、接種量、培養(yǎng)時(shí)間和料液比等會(huì)對(duì)菌株的生長代謝以及菜粕和豆粕分解能力造成影響。為提高菌株的生長能力和水溶性氨基酸產(chǎn)量,采用正交試驗(yàn)、PB試驗(yàn)和BBD試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,以充分發(fā)揮混合菌株的代謝能力,提高發(fā)酵產(chǎn)物得率。

固體發(fā)酵過程中基質(zhì)含水量、pH、發(fā)酵時(shí)間、通氣量和混菌組成等對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物有著很大影響[25]。筆者研究中PB試驗(yàn)表明,發(fā)酵時(shí)間、pH及料水比可顯著影響發(fā)酵結(jié)果。發(fā)酵時(shí)間是影響發(fā)酵效果的一個(gè)重要因素[26]。選擇合適的發(fā)酵時(shí)間,不但能有效地提高發(fā)酵效率,還能減少因發(fā)酵過度而產(chǎn)生的不必要浪費(fèi)。筆者研究發(fā)現(xiàn),發(fā)酵時(shí)間會(huì)顯著影響氨基酸含量,隨著時(shí)間的增加,氨基酸含量呈先增高后降低趨勢(shì),這說明微生物發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸并非是時(shí)間越長越好,這與多數(shù)研究結(jié)果[5]一致。這可能是由于時(shí)間延長,發(fā)酵基質(zhì)內(nèi)大量微生物會(huì)優(yōu)先利用被分解的小分子蛋白合成自身微生物菌體蛋白。pH的變化可引起細(xì)胞膜電荷發(fā)生變化致使膜的通透性改變,從而影響微生物對(duì)于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力,以及改變營養(yǎng)物質(zhì)的可給性,影響代謝過程中酶的活性[27]。料水比是影響微生物活性的重要因素,水分過高會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)黏性增加并減少基質(zhì)內(nèi)氣體交換,但能促進(jìn)基質(zhì)內(nèi)營養(yǎng)成分和菌體的流動(dòng)性[28];而基質(zhì)水分過低會(huì)影響乳酸菌活性,菌體生長受到抑制,酶的產(chǎn)量減少[29]。筆者試驗(yàn)中最佳料水比為1∶7.008,這一研究結(jié)果雖比多數(shù)研究者的報(bào)道高,但在氨基酸的最終產(chǎn)量上,游離氨基酸含量達(dá)到76.8 g·kg-1,高于多數(shù)研究結(jié)果[5]。筆者研究還發(fā)現(xiàn),接種量對(duì)氨基酸含量和其他指標(biāo)的影響不顯著,這可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長,各接種量最終都會(huì)達(dá)到一個(gè)基質(zhì)容量內(nèi)的最大微生物量[30]。

不同菌株配比對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的效果有明顯影響。王永紅等[6]等使用兩株產(chǎn)蛋白酶菌株嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌和短小芽孢桿菌,以菜粕為原料進(jìn)行固體發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸肥料,最終獲得53.99 g·kg-1的游離氨基酸含量,但未進(jìn)行兩株菌混菌比例的優(yōu)化。另外,多數(shù)研究者使用的混菌均為細(xì)菌,而筆者試驗(yàn)使用的混菌包含真菌和細(xì)菌,真菌在發(fā)酵過程中菌絲直接刺入固體基質(zhì),這對(duì)原材料的利用有著更為積極的作用[31]。

不同的優(yōu)化步驟也會(huì)對(duì)最終優(yōu)化結(jié)果產(chǎn)生影響。與李燕等[32]的研究結(jié)果相比,在菌株優(yōu)化上筆者試驗(yàn)采用真菌與細(xì)菌的混菌,并對(duì)菌株進(jìn)行了優(yōu)化選擇;在發(fā)酵的各因素水平優(yōu)化上,多數(shù)研究僅開展了單因素及正交試驗(yàn),未提前對(duì)影響因素進(jìn)行顯著性篩選。雖然最終優(yōu)化結(jié)果的發(fā)酵時(shí)間較短,能加速生產(chǎn),但存在對(duì)不顯著因素進(jìn)行優(yōu)化的可能,這對(duì)提升最終產(chǎn)量起到消極作用;在氨基酸的最終產(chǎn)量上,李燕等[32]將菜粕脫毒后得到的氨基酸含量低于筆者試驗(yàn)結(jié)果,但對(duì)菜粕進(jìn)一步水解后,氨基酸含量大大提升?？梢?通過對(duì)氨基酸發(fā)酵進(jìn)行優(yōu)化后,采用理化方法可進(jìn)一步提升發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸含量。

通過優(yōu)化試驗(yàn),筆者發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵處理后終產(chǎn)物水溶肥中微量、中量元素及氨基酸含量較為豐富,植物體內(nèi)微量元素多為酶的組成成分,而中量元素具有參與調(diào)節(jié)植物代謝、合成葉綠素和作為酶的活化劑等功能[33-34]。氨基酸具有促進(jìn)作物新陳代謝、提高光合作用速率、迅速補(bǔ)充作物多種營養(yǎng)元素、調(diào)控作物營養(yǎng)生長等多種功效。氨基酸除了可以被植物更好地吸收利用外,還可以與中、微量元素形成穩(wěn)定性強(qiáng)的螯合物,減少元素之間的拮抗作用,增加植物對(duì)中、微量元素的吸收[35]。

4 結(jié)論

筆者試驗(yàn)以豆粕和菜粕為原料,采用混合發(fā)酵工藝生產(chǎn)氨基酸水溶肥,通過對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行多步優(yōu)化,探究最佳發(fā)酵參數(shù)。利用PB試驗(yàn)篩選出具有顯著性影響的發(fā)酵因素為發(fā)酵時(shí)間、起始pH和料水比,顯著性由高到低依次為發(fā)酵時(shí)間、料水比和起始pH。通過BBD試驗(yàn),得到顯著影響因素和游離氨基酸含量之間的回歸曲線,進(jìn)一步通過Expert Design繪制顯著影響因素交互作用對(duì)游離氨基酸含量的響應(yīng)面曲線,結(jié)果顯示最佳發(fā)酵組合為發(fā)酵時(shí)間217.68 h,起始pH 9.12,料水比1∶7.008,接種量3%,翻料間隔24 h。經(jīng)驗(yàn)證,游離氨基酸產(chǎn)量達(dá)到76.8 g·kg-1。上述研究結(jié)果對(duì)于農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用以及發(fā)展生態(tài)高值農(nóng)業(yè)和提升土壤質(zhì)量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。