高嘉雯 朱旭江，* 姚世霞 牛鈺婷

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730070

甘草多糖膠囊系經(jīng)水提醇沉法提取甘草中的多糖，加輔料制成的膠囊劑，為甘肅省中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，臨床用于提高免疫力[1-2]。該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用3，5-二硝基水楊酸比色法(DNS)，單點外標(biāo)法測定甘草多糖的含量，試驗時發(fā)現(xiàn)操作過程復(fù)雜，試劑配制耗時，且輔料存在干擾，導(dǎo)致結(jié)果重現(xiàn)性較差。常用的多糖測定方法有：苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、DNS法等[3-5]。其中，苯酚-硫酸法操作簡便，測定快速，較為常用[6-7]。許多研究[8-10]發(fā)現(xiàn)，苯酚-硫酸法在測定結(jié)果的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性上均優(yōu)于蒽酮-硫酸法。有研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，在同質(zhì)量濃度下，對比葡萄糖對照品溶液吸光度，苯酚-硫酸法的吸光度大于蒽酮-硫酸法和DNS法，表明苯酚硫酸法的測定結(jié)果更靈敏。因此，通過研究，建立了苯酚-硫酸比色法測定甘草多糖膠囊的含量，并通過正交實驗設(shè)計優(yōu)化顯色條件，方法簡便準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Lambda365紫外可見分光光度計(PerkinElmer公司)；MS205DU十萬分之一天平(瑞士梅特勒公司)；ME204電子天平(瑞士梅特勒公司)；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；漩渦混合器(IKA VORTEX2)。

1.2 試藥 甘草多糖膠囊(批號分別為:200402、200403、200301，甘肅省中醫(yī)院提供)；D-無水葡萄糖(批號：110833-201707，含量99.9%，中國食品藥品檢定研究院)蒽酮、苯酚、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、硫酸，均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取D-無水葡萄糖對照品103.49 mg，置100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取儲備液5 mL，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取甘草多糖膠囊內(nèi)容物適量，混勻，研細，精密稱取0.1 g，置250 mL量瓶中，加水200 mL，旋渦振蕩器混合5 min，超聲(功率500 W，頻率40 kHz)處理30 min，放冷至室溫，加水至刻度，搖勻，取適量，過濾，精密量取濾液5 mL，置10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 最大吸收波長的測定 精密吸取0.4 mL“2.1.1”項下對照品溶液，置刻度試管中，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，振蕩搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，立即搖勻，冷卻至室溫。以相應(yīng)試劑為空白，在400～700 nm掃描光譜。由圖1結(jié)果可知對照品溶液在490 nm處有最大吸收，故選擇490 nm為測定波長。

圖1 對照品溶液的可見光譜圖

2.3 正交實驗設(shè)計優(yōu)化顯色條件 通過前期實驗發(fā)現(xiàn)，苯酚和硫酸的加入量、反應(yīng)時間均對結(jié)果有較大影響，因此，采用L9(34)正交試驗設(shè)計，以吸收度為考察指標(biāo)優(yōu)選最佳顯色條件，并運用SPSS 27.0統(tǒng)計軟件對試驗結(jié)果進行方差分析。正交試驗因素與水平見表1，正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果表

表3 方差分析結(jié)果表

由表2直觀分析可知，各因素對綜合評分影響的順序為B>A>C；由表3的方差分析可知，濃硫酸用量對顯色具有顯著意義。綜合直觀分析和方差分析結(jié)果，確定總多糖含量測定條件的最佳工藝條件為A2B1C3，即苯酚用量為1 mL，硫酸用量為5 mL，放置時間為30 min。經(jīng)對同一批樣品制備3批供試品溶液進行驗證，結(jié)果RSD為3.0%(n=3)，顯色條件方法可行。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取葡萄糖對照品溶液0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL，分別置具塞刻度試管中，加水至1 mL，搖勻，加入5 %苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入硫酸5 mL，搖勻，放置30 min，加水至10 mL，冰浴冷卻，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(2020版中國藥典通則0101)，在490 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為方程為：y=0.0048x+0.0252，r=0.9995，表明葡萄糖在0.0621～0.1656 mg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 專屬性考察 按處方比例及制備工藝，制成不含甘草多糖的陰性樣品，按“2.1.2”制成供試品溶液，測定吸收度。結(jié)果吸收度小于0.001，表明輔料不干擾實驗，有較好的專屬性。

2.6 精密度試驗 精密吸取“2.1.1”項下葡萄糖對照品溶液0.4 mL，按“2.4”項下方法，重復(fù)測定吸光度6次，結(jié)果6次吸光度的RSD=0.06%(n=6)，表明精密度較好。

2.7 重復(fù)性試驗 取甘草多糖膠囊(批號：200402)粉末約0.1 g，精密稱定，平行6份，按“2.1.2”制成供試品溶液，按照“2.4”項下方法測定其吸光度A，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算供試品溶液中葡萄糖的含量(mg/g)。結(jié)果平均含量為345.98 mg/g，RSD=1.88 %(n=6)。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批號樣品(批號：200402)，精密稱取0.1 g，按“2.1.2”項下方法制成供試品溶液，按照“2.4”項下方法測定其吸光度，每間隔 5 min測定1次，共測定6次。結(jié)果平均吸光光度為0.3864，RSD值為1.93 %(n=6)。表明樣品甘草多糖測定在30 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 加樣回收試驗 取已知含量的甘草多糖膠囊(批號：200402)9份，每份0.05 g，精密稱定，分別精密加入其樣品多糖含量的50 %、100 %、150 %的對照品溶液，每個比例加3份，按“2.1.2”制成供試品溶液。分別精密移取 1 mL，按照測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定其吸光度，測定平均加樣回收率為99.5%，RSD = 3.0%(n=9)，表明回收率良好。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收試驗結(jié)果表

2.10 樣品的含量 測定取3批甘草多糖膠囊各0.1 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下方法測定吸光度，計算其中多糖含量。結(jié)果見表5。

表5 樣品的含量測定結(jié)果表

3 討論

苯酚-硫酸法是利用多糖在濃硫酸作用脫水生成糠醛衍生物，糠醛與苯酚生成橙黃色化合物，再以比色法測定[13]。本試驗在單因素試驗基礎(chǔ)上，建立正交試驗設(shè)計，考察了苯酚、濃硫酸用量和反應(yīng)時間3個因素對甘草多糖含量測定的影響。最終確顯色條件為即加入苯酚1 mL，硫酸5 mL，放置時間為30 min。該方法操作簡便，試劑易得，能快速準(zhǔn)確測定甘草多糖的含量。

此外，分別選用超聲法、回流法、水浴保溫法以及直接溶解法等4種方式作為樣品中多糖的提取方法制備供試品溶液，在490 nm處測定吸光度值，結(jié)果顯示，超聲法測定結(jié)果較高，且操作簡便，故選用其作為樣品的制備方法。

通過方法學(xué)考察，驗證了本方法精密度高，重復(fù)性好，穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度均較好。采用苯酚-硫酸法測定甘草多糖膠囊中多糖的含量，方法可行，操作簡單，可用于甘草多糖膠囊的質(zhì)量控制，對指導(dǎo)臨床用藥及制訂制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有一定參考價值。