汪宇軒　周濤　周逸文　李齊升　王卉　單宏英

摘? ? 要：梨是我國(guó)僅次于蘋(píng)果的重要水果，隨著種植面積的增大，在生產(chǎn)過(guò)程中梨樹(shù)易遭受多種病害的威脅，其中輪紋病是嚴(yán)重威脅梨產(chǎn)業(yè)的病害之一，常造成重大經(jīng)濟(jì)損失。梨是天津薊州區(qū)特色水果之一，輪紋病主要危害成熟期果實(shí)，化學(xué)防治效果不明顯，且該病害病原菌種類(lèi)呈多樣化。為了明確致病菌種類(lèi)，采用組織分離法、形態(tài)學(xué)比較分析、致病性檢測(cè)和分子生物學(xué)手段對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：于病樣組織中分離得到一株真菌ZT98，在PDA培養(yǎng)基上呈灰色圓形菌落，菌絲有隔膜，尖端較細(xì)，致病性分析結(jié)果顯示，菌株ZT98接種2～3 d即出現(xiàn)同心淺褐色輪紋，發(fā)病后期果實(shí)呈黑褐色皺縮，表層布滿一層深灰色菌絲和黑點(diǎn)，與田間癥狀基本一致；提取ZT98基因組DNA后進(jìn)行 ITS基因擴(kuò)增并測(cè)序，在NCBI獲得基因序列登錄號(hào)為OR054159，ITS基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，ZT98與葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）聚于同一分支，同源性為100%。綜上，本研究分離得到了一株天津地區(qū)梨輪紋病致病菌ZT98，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和ITS序列比對(duì)分析，明確了ZT98的分類(lèi)地位，為該病害的精確診斷和有效防治提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：梨；輪紋病；葡萄座腔菌；ITS

中圖分類(lèi)號(hào)：S432.1? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.09.008

Isolation and Identification of A Pathogen Causing Pear Ring Spot in Tianjin

WANG Yuxuan ZHOU Tao ZHOU Yiwen LI Qisheng WANG Hui SHAN Hongying

（College of Horticulture and Landscape Architecture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300392， China）

Abstract： Pear， second only to apples， is an important fruit in China. Various diseases are prone to attack pear during cultivation and production with the increased planting area. Ring rot， causing significant economic losses frequently， is one of the serious diseases that endangers the pear industry. The pathogens of pear ring rot are a little diverse according to the previous studies. Therefore， this study tried to isolate and identify the pathogens of ring rot by tissue direct isolation， morphological analysis， pathogenicity detection and molecular determination. The results indicated that a strain ZT98 was obtained after isolation and purification of snow pear ring spot infected samples， which showed gray round colonies on PDA medium. Mycelia of ZT98 had diaphragm with a thinner top. Pathogenicity detection according to Koch's rules displayed that ZT98 was a pathogen caused serious symptoms on pear fruits. The concentric brown rings were consistent with the symptoms in the field. The infected sites became dark brown at the later infecting stage but without spores were observed. Phylogenetic analysis of ZT98 was performed by extracting the genomic DNA and amplifying ITS. The ITS Genebank accession number of ZT98 was OR054159. ZT98 was clustered in the same branch as Botryosphaeria dothidea with 100% homology. In conclusion， this study determined the pathogen causing pear ring rot in Tianjin， providing a basis for accurate diagnosis and effective control of this disease.

Key words： pear；pear ring rot；Botryosphaeria dothidea；ITS

梨是薔薇科梨屬的一種喬木植物，有“天然礦泉水”之稱(chēng)。梨在我國(guó)的種植歷史十分悠久，最早可追溯到春秋戰(zhàn)國(guó)時(shí)期。我國(guó)是梨種植大國(guó)，梨的種植面積僅次于蘋(píng)果，在我國(guó)占有重要的經(jīng)濟(jì)地位[1-3]，種植地區(qū)主要分布在16個(gè)省、直轄市，包括華北、華中、東北、西北、魯東等地區(qū)，華南和西南地區(qū)種植面積相對(duì)較少。在種植生產(chǎn)過(guò)程中，梨常遭受多種病害的威脅，如梨銹病、黑星病、輪紋病和黑斑病等[4]。梨輪紋病又叫粗皮病或瘤皮病，是我國(guó)北方梨主產(chǎn)區(qū)的重要病害之一，該病害受濕度影響較大，在多雨年份危害嚴(yán)重。梨輪紋病主要由葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）病原菌引起，在梨的樹(shù)干、果實(shí)和葉片均造成嚴(yán)重同心輪紋癥狀，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致葉片脫落、果實(shí)腐爛或樹(shù)勢(shì)衰弱，造成大面積爛果和果園絕產(chǎn)[1]。

梨輪紋病最早在日本被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)在我國(guó)東北和西南地區(qū)報(bào)道[1， 3]。近年來(lái)梨輪紋病病害在亞洲擴(kuò)展速度快，已遍布韓國(guó)等鄰國(guó)梨產(chǎn)業(yè)園區(qū)[5]。化學(xué)防治梨輪紋病病害常造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留，選育抗病品種已經(jīng)成為優(yōu)先選擇，但針對(duì)梨輪紋病抗病品種和有效藥劑的篩選報(bào)道較少，種質(zhì)資源的收集和鑒定也需要大量的人力物力和時(shí)間。張璐等[6]發(fā)現(xiàn)，碭山酥梨和雪花梨抗輪紋病菌的能力顯著優(yōu)于豐水梨和南果梨，且通過(guò)藥劑篩選發(fā)現(xiàn)咯菌腈、氟啶胺和咪鮮胺對(duì)梨輪紋病菌具有明顯的抑制效果。

梨是天津的特色水果之一，種植面積達(dá)6萬(wàn)hm，其中靜海區(qū)（約2萬(wàn)hm）、薊州區(qū)（約3萬(wàn)hm）、北辰區(qū)、武清區(qū)和西青區(qū)共計(jì)種植約1萬(wàn)hm，主打優(yōu)質(zhì)精品梨的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)入市場(chǎng)。薊州區(qū)具有悠久的梨樹(shù)種植歷史，種植區(qū)域覆蓋11個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)100多個(gè)旅游村和景區(qū)。部分梨園近年發(fā)現(xiàn)較嚴(yán)重的輪紋病病害，平均發(fā)病率達(dá)30%～50%，大部分果園發(fā)病率在30%[7]。發(fā)病果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量均下降，影響樹(shù)勢(shì)和果園的長(zhǎng)期發(fā)展，且化學(xué)藥劑對(duì)該病害的防治效果不顯著，給果農(nóng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。梨輪紋病的致病菌種類(lèi)在不同梨產(chǎn)區(qū)呈多樣化[8-9]，同一病原菌在不同地區(qū)導(dǎo)致的癥狀有顯著差別[10]。因此，確定輪紋病的致病菌對(duì)于該病害的防治至關(guān)重要。本研究通過(guò)對(duì)天津薊州區(qū)下?tīng)I(yíng)鎮(zhèn)梨園輪紋病致病菌的分離純化、形態(tài)學(xué)比較、致病性檢測(cè)和分子生物學(xué)鑒定等手段，明確了梨輪紋病致病菌種類(lèi)和分類(lèi)地位，為該病害的田間診斷和有效防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害樣品采集

梨果實(shí)輪紋病樣品采集自天津市薊州區(qū)下?tīng)I(yíng)鎮(zhèn)梨園（N40°18′ ，E117°45′），采樣梨園輪紋病發(fā)病程度約30%。

1.2 病原菌分離純化和形態(tài)觀察

選取有典型輪紋病病害癥狀的雪梨果實(shí)，將其病健交界處組織切成若干個(gè)0.5 cm×0.5 cm小塊后，經(jīng)75 % 酒精消毒45 s，無(wú)菌水潤(rùn)洗3次后，待組織風(fēng)干水分時(shí)，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，培養(yǎng)皿封口后于28 ℃ 培養(yǎng)3～5 d。PDA培養(yǎng)基配方如下：馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水定容至1 000 mL。將生長(zhǎng)單一無(wú)污染菌落采用菌餅打孔法進(jìn)行純化，培養(yǎng)過(guò)程中觀察記錄分離菌株的生長(zhǎng)特征，包括病原菌的菌絲、孢子、孢子梗和孢子囊等典型形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3 病原菌的致病性檢測(cè)

依據(jù)柯赫氏法則（Koch's Rule）對(duì)分離菌株進(jìn)行致病性檢測(cè)。雪梨果實(shí)經(jīng)1% 次氯酸鈉和75% 酒精各消毒30 s，再置于無(wú)菌水中潤(rùn)洗3次，待表皮風(fēng)干水分后，用無(wú)菌針于接種點(diǎn)刺傷雪梨果實(shí)表皮制造輕微傷口從而利于病原菌侵染。于PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5 d的分離菌株菌餅置于大小一致的雪梨果實(shí)接種點(diǎn)上，每個(gè)果實(shí)接種一塊菌餅，無(wú)菌培養(yǎng)基接種雪梨果實(shí)為陰性對(duì)照。接種后將梨果實(shí)置于無(wú)菌濾紙保濕的培養(yǎng)皿中，利用無(wú)菌膜封口利于保濕和防止雜菌污染，于28 ℃ 培養(yǎng)并觀察和記錄發(fā)病情況。在發(fā)病梨果實(shí)組織的病健交界處再次采用1.2中描述的方法分離純化病原菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，確保與接種菌株是同一種菌[11]。

1.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

將分離菌株于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌牙簽挑取收集菌絲于1.5 mL無(wú)菌管中，采用Biowott真菌DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，檢測(cè)濃度后利用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證DNA質(zhì)量。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察該致病菌屬應(yīng)是葡萄座腔菌屬的真菌，利用真菌rDNA-ITS通用引物（ITS1F：CCGTAGGTGAACCTG；ITS4R：TCCTCCGCTTATTGATATGC），采用Takara的PrimeSTAR Max Premix試劑盒（R045A）對(duì)ITS基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體系50 μL：PrimeSTAR Max Premix 25 μL、ITS1F和ITS4R引物各2.0 μL、DNA模板溶液2.0 μL、ddH2O 19.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃ 預(yù)變性1 min，98 ℃ 變性10 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min；共35個(gè)循環(huán)；最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后72 ℃ 延伸10 min；4 ℃ 條件下終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，委托華大基因有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將ITS基因序列在NCBI中BLAST比對(duì)同源性，篩選同源性高的序列并利用MEGA 11.0中鄰接法（neighnour joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，明確致病菌株的種類(lèi)和分離地位[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪梨輪紋病危害癥狀

梨輪紋病病原菌可危害果樹(shù)樹(shù)干、枝條、葉片和果實(shí)，其中對(duì)于成熟期的果實(shí)危害較為嚴(yán)重，影響果實(shí)成熟和質(zhì)量，給果農(nóng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病原菌危害初期形成淺褐色水漬斑點(diǎn)，逐漸擴(kuò)大形成同心的淺褐色環(huán)形輪紋，環(huán)形輪紋間是健康雪梨組織顏色。果實(shí)發(fā)病處的表皮脆軟，若果園濕度大，擠壓易流出較為粘稠的褐色液體，并有酸臭味道。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)病點(diǎn)顏色由淺褐色逐漸變成深褐色，病果持續(xù)發(fā)病10 d左右即全部腐爛，病斑呈黑褐色皺縮，因失水而變成僵果，表層布滿一層深灰色菌絲并且布滿黑點(diǎn)（圖1-A和圖1-B）。挑取雪梨果實(shí)病斑處的菌絲和子實(shí)體進(jìn)行顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)無(wú)隔菌絲，未見(jiàn)孢子（圖1-C）。

2.2 雪梨輪紋病病原菌的分離純化

雪梨輪紋病的病健交界處經(jīng)病原物分離后得到形態(tài)一致的菌落2個(gè)，進(jìn)一步純化和形態(tài)學(xué)觀察確認(rèn)是同一種菌。菌株ZT98在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)初期呈蓬松灰白色絨毛狀，菌落邊緣光滑且透明，菌絲無(wú)色，具有隔膜和較細(xì)的分枝，菌絲寬度約2.3～5.6 μm 生長(zhǎng)至5～7 d即長(zhǎng)滿直徑為9 cm的培養(yǎng)皿，且無(wú)色素沉積（圖2），繼續(xù)培養(yǎng)至14 d菌落呈灰白色，且菌板背面中心處變?yōu)楹谏?，但未觀察到孢子或產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。

2.3 菌株ZT98的致病性檢測(cè)

將分離得到的菌株ZT98依據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行致病性驗(yàn)證，通過(guò)菌餅打孔法直接回接到健康且大小均一的雪梨果實(shí)上，同時(shí)接種PDA培養(yǎng)基空白菌餅作陰性對(duì)照，接種的第1天、第3天、第5天和第7天對(duì)照均無(wú)癥狀（圖3-A、圖3-B、圖3-C、圖3-D）。接種菌株ZT98的雪梨果實(shí)3 d后在接種點(diǎn)形成褐色水漬狀斑圈，接種的第5天和第7天，褐色同心輪紋逐漸擴(kuò)大，且病斑顏色變至深褐色，水漬狀面積擴(kuò)大，具有酸臭味道（圖3-E、圖3-F），這與梨輪紋病田間發(fā)病癥狀一致。再次通過(guò)分離純化得到與ZT98菌落形態(tài)一致的菌株，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落逐漸由淺灰色變成深灰色，（圖3-I、圖3-J、圖3-K、圖3-L）。因此，本研究明確ZT98是雪梨果實(shí)輪紋病的致病菌株。

2.4 菌株ZT98的分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)對(duì)菌株ZT98的rDNA-ITS序列（約550 bp）在NCBI網(wǎng)站的Genebank獲得登錄號(hào)（OR054159），經(jīng)基因序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，ZT98與葡萄座腔菌（B. dothidea）聚于同一分支，同源性高達(dá)100%（圖4），說(shuō)明采樣梨園輪紋病致病菌種類(lèi)單一，無(wú)多種病原菌復(fù)合侵染。因此，天津地區(qū)雪梨果實(shí)輪紋病病原菌為葡萄座腔菌（B. dothidea）。

3 討論與結(jié)論

我國(guó)是世界上梨種植和生產(chǎn)大國(guó)，隨著種植面積的增大，梨常遭受多種病原菌的威脅，輪紋病是限制梨產(chǎn)業(yè)高效發(fā)展的重要病害之一，其分布廣泛，嚴(yán)重時(shí)造成絕產(chǎn)。輪紋病的病原菌擴(kuò)展到木質(zhì)部后，影響水分和養(yǎng)分的運(yùn)輸，導(dǎo)致梨樹(shù)樹(shù)勢(shì)削弱，或枯萎死亡。輪紋病病原菌在梨樹(shù)內(nèi)可存活6年之久，還可侵染蘋(píng)果、山楂、杏、桃、棗等多種果樹(shù)，一旦發(fā)病應(yīng)及時(shí)刮除病原殘?bào)w，并選育抗病品種[13-14]。輪紋病病害以化學(xué)防治為主，多菌靈、烯唑醇或苯醚甲環(huán)唑等均具有較好的防效[15-17]。生物防治能有效減少化學(xué)藥劑的使用量并緩解抗藥性，但目前梨輪紋病的生物菌劑如枯草芽孢桿菌和木霉菌等，防治效果仍不穩(wěn)定。

梨輪紋病致病菌的鑒定是有效防治該病害的關(guān)鍵因素之一，天津地區(qū)梨輪紋病致病菌尚無(wú)明確分類(lèi)。本研究將采集自天津市薊州區(qū)梨園果實(shí)輪紋病樣品進(jìn)行了致病菌的分離純化，得到一株真菌ZT98，菌絲有隔，分支頂端尖細(xì)，但未發(fā)現(xiàn)分生孢子，與龍瓏等[18]和冷偉鋒等[19]的報(bào)道一致。本研究對(duì)ZT98的產(chǎn)孢條件進(jìn)行了摸索，將接種病原菌的雪梨果實(shí)置于容器中在自然光下培養(yǎng)，或?qū)⒕逵?5 ℃黑光燈下培養(yǎng)10～20 d，均未觀察到孢子。因此，筆者推測(cè)菌株ZT98的產(chǎn)孢條件可能較為苛刻，除溫度和光照外，還可能受到其他環(huán)境因素和生理生化特性的影響，或僅在活體梨樹(shù)或果實(shí)發(fā)病后期才能產(chǎn)生分生孢子。

依據(jù)柯赫氏法則對(duì)分離獲得的菌株進(jìn)行致病性檢測(cè)是病原菌鑒定的關(guān)鍵。因菌株的致病性受到環(huán)境、寄主品種等多種因素的影響，有多種植物病害病原物即使在田間有明顯的致病力，但在實(shí)驗(yàn)室條件下致病性會(huì)減弱或失去致病力[20]。將分離得到的菌株ZT98回接到雪梨果實(shí)后出現(xiàn)的癥狀與采集樣品癥狀一致，因此推測(cè)ZT98是雪梨果實(shí)輪紋病的致病菌。進(jìn)一步分析菌株ZT98與其他地區(qū)梨或蘋(píng)果輪紋病致病菌基因組序列的差異基因，篩選與致病性或癥狀有關(guān)的關(guān)鍵基因，能為梨輪紋病抗性基因篩選和抗病品種的培育提供依據(jù)。

真菌菌落形態(tài)和菌絲結(jié)構(gòu)特征常受到培養(yǎng)條件的影響，導(dǎo)致植物病原真菌鑒別存在一定差異[21]，因此依據(jù)癥狀、菌落形態(tài)和培養(yǎng)特征進(jìn)行病原菌的鑒定是不充分的，難以明確到種或亞種[22-23]。而已發(fā)展成熟且靈敏的分子生物學(xué)技術(shù)分析菌株ZT98的ITS序列是本研究中雪梨果實(shí)輪紋病致病菌鑒定的關(guān)鍵[24-25]。通過(guò)分析看家基因?qū)⒉≡镨b定到種或亞種，是致病菌鑒定分類(lèi)的常用技術(shù)。但葡萄座腔菌屬的看家基因EF1-α、GPD、HSP或H3等作為種類(lèi)鑒定的依據(jù)仍存在一定的爭(zhēng)議[26]。梨輪紋病致病菌自然界常見(jiàn)的無(wú)性態(tài)為輪紋大莖點(diǎn)霉（Macrophoma kuwatsukai Hara.）[27]，有性態(tài)致病菌B. dothidea主要通過(guò)皮孔和傷口侵染梨樹(shù)樹(shù)干或果實(shí)形成典型的枝干或果實(shí)輪紋癥狀。濕度大的條件下引起梨或蘋(píng)果的輪紋病癥狀，干燥條件下引起果樹(shù)干腐癥狀[12]。在美國(guó)梨輪紋病的致病菌是B. dothidea [28]，B. dothidea包括4個(gè)基因型，引起蘋(píng)果輪紋病的病原菌包括2種，即B. kuwatsukai和B. dothidea。我國(guó)梨輪紋病致病菌分為2種基因型，分別是B. berengeriana 和 B. dothidea，它們致病性存在一定分子分化，但被證實(shí)ITS及看家基因的序列一致，均被命名為B. dothidea [9]。因此，本研究分離純化了一株天津薊州地區(qū)梨輪紋病病原菌，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和ITS基因序列分析，明確了該病致病菌是B. dothidea，為梨輪紋病病害的精準(zhǔn)診斷、抗病品種篩選和有效防治奠定基礎(chǔ)。

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