仝文君 張玉申 陳曉璐 雷瑤 周云靜 都立輝

摘要：研究分析了紫蘇醛對黃曲霉細(xì)胞壁的作用機(jī)理。通過對麥角固醇含量、掃描電鏡菌絲形態(tài)觀察、胞內(nèi)物質(zhì)外泄等指標(biāo)的測定以及胞壁相關(guān)基因表達(dá)量的變化，確定紫蘇醛通過抑制黃曲霉細(xì)胞膜組分合成而破壞細(xì)胞膜完整性。結(jié)果表明：紫蘇醛對黃曲霉最小抑菌濃度為0.125 μL/mL；霉菌質(zhì)膜中的麥角固醇含量由582.75 μg/g下降到281.85 μg/g；紫蘇醛處理后的黃曲霉菌體受損嚴(yán)重，孔洞與凹陷明顯，菌體變形；胞內(nèi)物質(zhì)大量外泄，霉菌細(xì)胞膜完整性降低。以上結(jié)果表明紫蘇醛通過抑制CYP51B、CHSB、CHSC等胞壁相關(guān)基因，抑制麥角甾醇合成，破壞質(zhì)膜完整性，進(jìn)而致使細(xì)胞膜滲透性被破壞，胞內(nèi)物質(zhì)外泄。

關(guān)鍵詞：紫蘇醛；黃曲霉；胞壁基因；抑菌機(jī)理

中圖分類號：Q939 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20230426

基金項(xiàng)目：江蘇省研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計劃（KYCX21_1531）。

Study on mechanism of perillaldehyde inhibiting the growth of Aspergillus flavus

Tong Wenjun， Zhang Yushen， Chen Xiaolu， Lei Yao， Zhou Yunjing， Du Lihui

（College of Food Science and Engineering， Nanjing University of Finance and Economics， Nanjing， Jiangsu 210023）

Abstract： In this study， we analyzed the mechanism of perillaldehyde in Aspergillus flavus cell walls. By observing the contents of ergosterol， the morphology of mycelia under scanning electron microscope， the determination of intracellular substance leakage， and the changes of cell wall related gene expression， perillaldehyde was determined to inhibit A. flavus fine synthesis of membrane components destroying membrane integrity. The results showed that the minimum inhibitory concentration of perillaldehyde against A. flavus was 0.125 μL/mL. The ergosterol content in mycoplasma plasma membrane decreased from 582.75 μg/g to 281.85 μg/g. After perillaldehyde treatment， A. flavus was seriously damaged， with obvious holes and depressions， and the bacteria were deformed. A large amount of intracellular substances leaked out and the integrity of mold cell membrane was reduced. These results indicated that perillaldehyde inhibited ergosterol synthesis and damaged plasma membrane integrity by inhibiting CYP51B， CHSB， CHSC and other cell wall related genes， thus resulting in the destruction of membrane permeability and the leakage of intracellular substances.

Key words： perillaldehyde， Aspergillus flavus， cell wall gene， bacteriostasis mechanism

黃曲霉（Aspergillus flavus）作為在大量淀粉基質(zhì)上生長的雜草狀霉菌[1]，污染了堅果、玉米、大豆、花生、稻谷等經(jīng)濟(jì)作物。在糧食的生長、收獲、倉儲、加工、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)中，也會產(chǎn)生大量的致癌性劇毒化合物黃曲霉毒素（aflatoxin， AFT）[2]。該毒素除了降低糧食本身的營養(yǎng)價值，造成較大經(jīng)濟(jì)損失以外，對動物和人體的健康也造成極大威脅[3]。黃曲霉毒素具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)異常性、免疫抑制性和致癌性，肝臟損害是其致病性的主要表現(xiàn)[4]。機(jī)體的免疫受抑制，進(jìn)而致使抗病力降低[5-6]。因此，控制黃曲霉的生長繁殖以及毒素的代謝累積，對保障儲糧安全與質(zhì)量控制具有重要的社會意義。令人唏噓的是，盡管各種抑菌物質(zhì)被廣泛用于抑制此類真菌的生長[7-8]，但耐藥菌株層出不窮，在毒性、高殘留、難降解和高成本等各方面仍然存在巨大的缺點(diǎn)[9-10]。因此，介于合成抗真菌劑的多重潛在耐藥性和副作用[11]，人們越來越關(guān)注天然抗真菌劑。植物來源的天然抗真菌劑以其廣譜抗菌性、生物可降解性、高揮發(fā)性和低殘留等特點(diǎn)已被認(rèn)為是傳統(tǒng)化學(xué)抑菌劑的理想替代品[12-13]。

紫蘇醛作為紫蘇中提取的一種天然的單萜物質(zhì)[14]，具有多種生物學(xué)特性，包括抗炎、抗真菌、抗感染、抗氧化、抗癌、抗過敏及降脂等生物學(xué)作用[15]。有研究[14，16]指出，紫蘇醛對絲狀真菌如黃曲霉菌、黑曲霉菌和白色念珠菌具有顯著的殺菌作用。故紫蘇醛在抑菌方面有廣闊的應(yīng)用前景。近年來，真菌細(xì)胞壁因其在真菌胞壁完整性中的重要作用，其胞壁組分關(guān)鍵合成酶常被作為開發(fā)新型殺菌藥物的靶點(diǎn)被認(rèn)為是開發(fā)新抗真菌治療的可能靶點(diǎn)[17]。石程仁等[18]發(fā)現(xiàn)0.2 mg/mL的紫蘇醛可抑制黃曲霉生長，并具有較高的抑制黃曲霉產(chǎn)毒能力。Tian等[19]發(fā)現(xiàn)紫蘇醛能夠通過抑制黑曲霉菌細(xì)胞壁麥角甾醇的合成發(fā)揮殺菌作用。因此有必要對紫蘇醛作用于黃曲霉的抑菌機(jī)理做進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)主要測定與黃曲霉細(xì)胞壁表型相關(guān)的麥角固醇、菌絲形態(tài)觀察、電導(dǎo)率等指標(biāo)，并對與胞壁合成相關(guān)的葡聚糖合成酶、4種幾丁質(zhì)合成酶等進(jìn)行熒光定量，逐層遞進(jìn)地研究紫蘇精油對黃曲霉菌細(xì)胞壁的作用機(jī)理，以期為進(jìn)一步闡述紫蘇醛抑菌機(jī)理提供理論依據(jù)和新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）：上海博微生物科技有限公司。

乙醇（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；血球計數(shù)板：上海求精生化試劑儀器有限公司；紫蘇醛：上海源葉生物科技有限公司；戊二醛（分析純）、乙醇（分析純）、氫氧化鉀（分析純）、正庚烷（分析純）：阿拉丁試劑有限公司；鉀離子試劑盒：南京建成生物有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒：諾唯贊生物科技有限公司。

AB104-N型電子天平：上海第二天平儀器廠；FE38型電導(dǎo)率儀：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；THZ-D型臺式恒溫振蕩器：上海百典儀器設(shè)備有限公司；GI54DP型立式高溫高壓滅菌鍋：致微公司；日立SU8020型掃描電鏡：日本日立公司；CJ-2D型超凈工作臺：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；Synergy H1型酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃曲霉菌孢子液制備

取純化后的野生型（WT）黃曲霉菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，在30 ℃黑暗培養(yǎng)4～6 d后，使用滅菌后的孢子洗脫液進(jìn)行洗脫收集，用血球計數(shù)板對孢子進(jìn)行計數(shù)，終濃度調(diào)至1×106個/mL后備用。

1.2.2 最小抑菌濃度（MIC）

根據(jù)Rodriguez-Tudela等[20]的方法，采用二倍稀釋法測定紫蘇醛的MIC。以不出現(xiàn)肉眼可見菌落的最低抑菌濃度定義為MIC。

1.2.3 麥角固醇含量測定

1.2.4 掃描電鏡觀察

參考Ju等[22]的方法略作修改。2%孢子液接種至含有不同濃度（0、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC）紫蘇醛的PDB培養(yǎng)基，30 ℃，160 r/min培養(yǎng)48 h，取適量菌絲體，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽（PBS，pH 7.2）洗滌并收集菌絲體。2.5%戊二醛固定2 h，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗3次，梯度乙醇系列脫水干燥后，進(jìn)行噴金鍍膜處理，10.0 kV下用掃描電鏡觀察菌絲體形態(tài)特征。

1.2.5 細(xì)胞膜滲透性測定

根據(jù)Bomfin等[23]的測定方法稍加修改，采用電導(dǎo)率來表示滲透率的變化。2%孢子液接種至PDB，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)48 h，抽濾得菌絲體。配制含有1/2 MIC、1 MIC、2 MIC紫蘇醛的無菌水，對照組為不添加紫蘇醛的無菌水。取1 g菌絲置于30 ℃、120 r/min培養(yǎng)12 h，間隔2 h取樣。用電導(dǎo)率儀測定黃曲霉的電導(dǎo)率。

1.2.6 紫蘇醛對黃曲霉菌絲K+泄露的影響

2%孢子液接種至PDB，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)48 h，抽濾得菌絲體。配制含有1/2 MIC、1 MIC、2 MIC紫蘇醛的無菌水，對照組為不添加紫蘇醛的無菌水。取1 g菌絲置于30 ℃、120 r/min培養(yǎng)12 h，間隔3 h取樣。用鉀離子試劑盒測定K+ 的含量。

1.2.7 RNA提取與熒光定量PCR（qRT-PCR）

取不同紫蘇醛濃度處理的菌株（1/4 MIC、1/2 MIC和3/4 MIC）培養(yǎng)48 h，以不添加紫蘇醛培養(yǎng)24 h的黃曲霉作為對照組。取液氮研磨后的菌體100 mg，加1 mL Trizol，勻漿處理，提取菌株RNA，超微量分光光度計測定提取RNA的純度和質(zhì)量。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用熒光定量PCR儀檢測相關(guān)基因相對表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，通過鄧肯檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析，顯著性差異P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑菌濃度

如圖1所示，不添加紫蘇醛的野生型對照組，孢子正常萌發(fā)，芽管延伸，基本生長成菌絲體狀；紫蘇醛濃度較低（0.031 25～0.125 μL/mL）時，隨紫蘇醛濃度的升高，黃曲霉孢子芽管長度逐漸變短，交聯(lián)不再致密，萌發(fā)被抑制；蘇醛濃度為0.25、0.5 μL/mL時，孢子不再萌發(fā)。表明黃曲霉的MIC為0.125 μL/mL。

2.2 麥角固醇含量測定

黃曲霉經(jīng)0、0.031 25、0.062 5、0.125 μL/mL的紫蘇醛處理后，其麥角固醇含量如圖2所示，處理組麥角固醇含量較對照組的顯著降低（P <0.05），且隨著紫蘇醛濃度的增加，菌體麥角固醇含量逐漸降低。麥角固醇是霉菌細(xì)胞壁的主要成分，是評價細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)。麥角固醇的合成受阻將會導(dǎo)致細(xì)胞膜功能的顯著障礙，使胞內(nèi)物質(zhì)泄露。Ferreira等[24]研究表明，麥角甾醇大多具有抑制麥角甾醇生物合成的作用，會損害蛋白質(zhì)的完整性和功能，導(dǎo)致滲透紊亂，從而影響真菌生長和增殖。李汶玥等[25]研究發(fā)現(xiàn)，二氧化氯及丁香肉桂精油均會影響禾谷鐮刀菌細(xì)胞膜的完整性，麥角固醇含量同樣出現(xiàn)了被抑制的現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)胞膜滲透性增強(qiáng)，從而抑制菌絲生長。由此可知，紫蘇醛通過破壞霉菌細(xì)胞壁的主要成分麥角固醇抑制黃曲霉生長，且這種抑制具有濃度依賴性。

2.3 掃描電鏡觀察

由圖3可知，未經(jīng)紫蘇醛處理的菌絲形態(tài)完整，菌絲整齊、均勻、表面光滑。而用0.031 25 μL/mL紫蘇醛處理的菌絲，表面變得不平整，部分產(chǎn)生褶皺與變形，0.062 5 μL/mL紫蘇醛處理的菌絲體，出現(xiàn)大量孔洞與凹陷，當(dāng)濃度增加到0.125 μL/mL時，菌絲體損傷更嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)斷裂。呂好新等[26]研究了肉桂-山蒼子復(fù)合精油對黑曲霉的影響，證實(shí)精油處理的黑曲霉BQM菌絲體損傷嚴(yán)重，發(fā)生皺縮、干癟、凹陷等變形現(xiàn)象。陳可欣等[27]研究表明，香樟精油處理后的灰綠曲霉細(xì)胞變形嚴(yán)重，霉菌表面明顯受損，精油處理會改變灰綠曲霉細(xì)胞的完整性與膜滲透性。由此推測，隨著紫蘇精油處理濃度的增加，菌絲體形態(tài)被嚴(yán)重破壞，細(xì)胞膜完整性喪失引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，菌絲體內(nèi)含物流出導(dǎo)致黃曲霉菌生長受阻。

2.4 細(xì)胞膜滲透性測定

在0～10 時內(nèi)，對照組未檢測到明顯變化，而經(jīng)不同濃度紫蘇醛處理的黃曲霉，電導(dǎo)率表現(xiàn)出了不同的增加趨勢（圖4（a）），電導(dǎo)率隨著時間的推移，逐漸升高，呈正相關(guān)性。暴露12 h后，0.031 25、0.062 5、0.125 μL/mL紫蘇醛處理組的電導(dǎo)率分別升至（170.6±6.53）、（238.6±6.01）、（269.1±9.98） μS/cm，顯著高于對照組。此現(xiàn)象與Hu等[28]的研究結(jié)果一致。這表明高濃度的紫蘇醛會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)成分泄漏和電解質(zhì)流出，使電導(dǎo)率顯著升高。

在0～12時，不同濃度紫蘇醛處理后的菌體的K+外泄?jié)舛扰c對照組相比，均表現(xiàn)出明顯差異（圖4（b）），尤以1 MIC和2 MIC最為顯著。其中菌體在紫蘇醛處理后的3～9 h，K+含量上升趨勢最為明顯。劉歡等[29]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)配精油破壞菌絲細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)部的K+、Na+等離子流出，且隨著精油濃度增加，細(xì)胞溶出物的釋放量和細(xì)胞膜滲透性明顯增加。蔣夢曦等[30]發(fā)現(xiàn)，Iturin A處理能使緩沖液中K+離子濃度顯著增加，表明Iturin A對匍枝根霉菌絲的細(xì)胞膜造成一定破壞，使得細(xì)胞膜上形成孔洞，胞內(nèi)物質(zhì)外泄。這表明高濃度的紫蘇醛能在更短時間內(nèi)對黃曲霉菌絲細(xì)胞膜造成破壞，且破壞程度劇烈，致使K+濃度急劇增加。其菌體細(xì)胞膜受到了不可逆的損傷。

本研究中電導(dǎo)率和電解液泄漏的增加證實(shí)菌體自身保護(hù)屏障被打破，紫蘇醛通過破壞細(xì)胞膜完整性對黃曲霉造成不利影響。

2.5 熒光定量PCR

經(jīng)紫蘇醛處理的黃曲霉的麥角固醇（CYP51B）和4種幾丁質(zhì)酶（CHSB、CHSC、CHSE、CHSG）表達(dá)下調(diào)，較對照組（CK）均顯著降低（圖5）。CYP51B基因的差異表達(dá)證實(shí)了紫蘇醛處理降低了黃曲霉細(xì)胞膜中甾醇的生物量，4種幾丁質(zhì)酶的差異表達(dá)也證明了紫蘇醛處理破壞了黃曲霉細(xì)胞壁的完整性。

3 結(jié) 論

本研究通過對麥角固醇含量、掃描電鏡菌絲形態(tài)觀察、胞內(nèi)物質(zhì)外泄等指標(biāo)的測定以及胞壁相關(guān)基因表達(dá)量的變化，確定紫蘇醛通過抑制黃曲霉細(xì)胞膜組分合成而破壞細(xì)胞膜完整性。采用二倍稀釋法，測定了紫蘇醛對黃曲霉的最小抑菌濃度為0.125 μL/mL；紫蘇醛處理能夠抑制菌絲麥角固醇的合成，導(dǎo)致黃曲霉菌絲內(nèi)部電解液以及K+的外泄，細(xì)胞膜滲透性增強(qiáng)，從而抑制菌絲生長；掃描電鏡觀察表明，紫蘇醛處理使黃曲霉菌體損傷嚴(yán)重，形成大量孔洞與凹陷。紫蘇醛處理后的CYP51B以及4種幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)量顯著降低，與上述表型結(jié)果具有一致性。

本研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇醛通過調(diào)節(jié)黃曲霉胞壁相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而影響麥角甾醇的合成，破壞質(zhì)膜完整性，進(jìn)而致使細(xì)胞膜滲透性被破壞，胞內(nèi)物質(zhì)外泄，影響多種酶進(jìn)行正常的合成和代謝，使菌體代謝受阻。

參 考 文 獻(xiàn)

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