劉姣，蔣超，黃凱偉，李潔，趙玉洋*，金艷，張?zhí)瘢瑥堓x，袁媛*

1.中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心，北京 100700；

2.華潤三九現(xiàn)代中藥制藥有限公司，廣東 深圳 518029

僵蠶為蠶蛾科昆蟲家蠶Bombyx moriLinnaeus 4～5 齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌Beauveria bassiana（Bals.）Vuillant 而致死的干燥體，味咸、辛，性平，歸肝、肺、胃經，具有息風止痙、祛風止痛、化痰散結等功效[1]。僵蠶配方顆粒是僵蠶飲片經炮制并按標準湯劑的主要質量指標加工制成的顆粒，其保持了僵蠶飲片的性味與功效，且不需煎煮、調配方便、使用可隨證組方，臨床用量大。由于動物藥中小分子物質的種類遠少于植物藥且特異性差，導致多味動物藥以同一小分子化合物為指標性成分缺乏專屬性[2-3]。飲片加工成為配方顆粒后失去了形態(tài)、顯微鑒別特征，為解決上述問題，已有研究者采用特異性聚合酶鏈式反應（PCR）[4-5]、DNA 指紋圖譜[6]等方法對配方顆粒進行鑒別。現(xiàn)有僵蠶配方顆粒、炒僵蠶配方顆粒、蜜麩炒僵蠶配方顆粒質量標準多采用薄層色譜法與對照藥材進行對比、高效液相色譜法測量尿苷、鳥苷、尿嘧啶（《貴州省中藥配方顆粒質量標準（第十批）》《北京市中藥配方顆粒標準（第二批）》《海南省中藥配方顆粒質量標準（第二批）》）或蘆丁、槲皮素、山柰酚、紫云英苷等[7-9]進行質量控制，缺乏專屬性。在失去形態(tài)鑒別和顯微特征的情況下，如何證明和表征僵蠶配方顆粒的原料基原為蠶蛾科昆蟲家蠶是目前配方顆粒工業(yè)化生產的難題。

動物藥蛋白含量高且種類豐富，可篩選獲得高特異性的標志蛋白用于專屬性鑒別研究。近年來，已有大量報道將多肽、蛋白用于中藥質量評價[10-17]。本研究擬通過液相色譜串聯(lián)質譜法（LC-MS/MS）對僵蠶配方顆粒特異性條帶進行定性定量分析，尋找穩(wěn)定且豐度較高的蛋白作為僵蠶配方顆粒的蛋白標志物，并建立十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析鑒別方法，此方法簡單易行，不需特殊設備，可為規(guī)范僵蠶及其產品質量提供參考。參照本研究建立的SDS-PAGE 蛋白指紋圖譜方法，也可進一步建立僵蠶配方顆粒中白僵菌的鑒別方法及其他動物藥材配方顆粒的真?zhèn)舞b別方法。

1 材料

1.1 儀器

Mini-PROTEAN Tetra System 型電泳槽、PowerPac? 系列電泳儀均購于Bio-Rad 公司；2100型掃描儀（UMAX公司）；Lynx 6000型冷凍離心機、Orbitrap Fusion Lumos 組合式質譜儀、Ultimate 3000型RSLC 納升級高效液相色譜儀均購于Thermo Fisher 公司；BLY-200E 型脫色搖床（博徠研科技有限公司）；5420型離心機（Eppendorf公司）。

1.2 試劑

4%～12% SurePAGE? 蛋白預制膠（金斯瑞生物科技有限公司，批號：C35122205）；考馬斯亮藍G-250、MS 級甲酸（Sigma 公 司，批號分別為DY0432、94318-50ML-F）；溴酚藍、硫脲、尿素、三氯乙酸（上海麥克林生化科技有限公司，批號分別 為 C12943636、C13661159、C13483667、C14121317）；冰乙酸、乙醇（西隴科學股份有限公司，批號分別為B2108161、B2111059）；丙酮（北京化工廠，批號：20190319）；LC-MS級水、乙腈、三氟乙酸（TFA）；吲哚乙酸（IAA）（Thermo Scientific公司，批號分別為W6-4、A996-4、85183、A39271）；Trypsin酶（Promega公司，批號：V5111）；二硫蘇糖醇（DTT，Vetec 公司，批號：V900830-5G）；Blue Plus? Protein Marker（北京全式金生物技術有限公司，批號：Q10531）。

1.3 樣品

18 批僵蠶藥材、18 批僵蠶飲片、3 批僵蠶提取物（批號：5220601Y～5220603Y）、18批僵蠶標準湯劑凍干粉（批號分別為2103001Y～2103015Y、220601Y～220603Y）、6 批僵蠶配方顆粒成品分別由華潤三九醫(yī)藥股份有限公司、北京康仁堂藥業(yè)有限公司、江陰天江藥業(yè)有限公司、廣東一方制藥有限公司提供，樣品信息見表1。另采集了不同動物藥材，共7種，用于檢測建立鑒別方法的專屬性。僵蠶藥材和其他7 種動物藥經中國中醫(yī)科學院中藥資源中心蔣超副研究員鑒定分別為家蠶、水蛭、鱉甲、紫河車、蛤蚧、土鱉蟲、全蝎、海龍（尖海龍），樣品保存于中國中醫(yī)科學院中藥資源中心。其他7種動物藥樣品信息見表2。以上海奈啟生物科技有限公司生產的僵蠶對照藥材為僵蠶配方顆粒陽性對照（批號：

表1 僵蠶樣品信息

表2 其他動物藥樣品信息

NQ1089-2205）。

2 方法

2.1 蛋白提取

取適量僵蠶配方顆粒，研磨成粉末，取粉末0.1 g，加入 0.1 mol·L-1乙酸鈉溶液（pH=5）1 mL，30 ℃振蕩提取1.5 h，13 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為52.5 mm），取上清液置-20 ℃保存?zhèn)溆?。取上清?50 μL置2 mL離心管中，加入三氯乙酸50 μL，混勻后10 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為31.1mm），棄上清液，沉淀中加丙酮300 μL，混勻后10 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為31.1 mm），棄去上清液，沉淀用蛋白裂解液100 μL（取尿素21.02 g、硫脲7.61 g，加水溶解并定容至50 mL）溶解。

2.2 SDS-PAGE

取溶解液25 μL至1個新的2 mL離心管中，再加入溴酚藍指示液5 μL并混合均勻，沸水浴處理10 min備用。分離膠體積分數(shù)為12%，加樣后60 V 恒壓電泳至溴酚藍指示液，距膠板底部邊緣1～2 cm 時結束電泳。凝膠片以考馬斯亮藍染色液處理45 min，棄去染色液，以脫色液處理至凝膠背景透明且條帶清晰。取凝膠片在凝膠成像儀上檢視，分析樣品蛋白差異。

2.3 LC-MS/MS分析

凝膠在掃描儀上掃描后，將40～50 kDa 的條帶用潔凈的刀片切下放入離心管中，參照文獻[18]方法將切下的條帶進行膠內酶解除鹽。樣品使用Ultimate 3000 型RSLC 納升級高效液相色譜系統(tǒng)，采 用Thermo Scientific PN 164535 Trap、Thermo Scientific PN 164941 分析柱，參考文獻[15]的方法進行液相及質譜參數(shù)設置。

2.4 質譜數(shù)據的蛋白數(shù)據庫搜尋分析

SEQUEST? HT搜索引擎在數(shù)據庫進行搜索和匹配。為了提高分析結果質量，降低假陽性率（FDR），采用Proteome Discoverer對檢索結果進行過濾：可信度在99%以上的肽段-譜圖匹配（PSMs）為可信PSMs，至少包含1 個unique 肽段（特有肽段）的蛋白為可信蛋白，僅保留可信肽段和蛋白，并進行FDR驗證，去除FDR>1%的肽段和蛋白。

3 結果與分析

3.1 SDS-PAGE鑒定條件的確定與耐用性考察

3.1.1 提取溶劑 為選出同時適宜僵蠶藥材、標準湯劑凍干粉、配方顆粒的蛋白提取方法，對0.1 mol·L-1乙酸鈉緩沖液（pH=5）、0.1 mol·L-1Tris-HCl 緩沖液（pH=9）、ddH2O 不同提取溶劑的蛋白提取效果進行對比。結果顯示，藥材均有明顯條帶，標準湯劑凍干粉條帶豐度較低，配方顆粒樣品條帶不清晰，僵蠶藥材、標準湯劑凍干粉、配方顆粒的共有條帶為40～50 kDa；相比其他2 種溶劑，0.1 mol·L-1乙酸鈉緩沖液（pH=5）提取的僵蠶藥材、標準湯劑凍干粉、配方顆粒成品均能產生清晰可辨的條帶。因此選擇0.1 mol·L-1乙酸鈉緩沖液（pH=5）作為溶劑（圖1）。

圖1 提取溶劑種類對僵蠶配方顆粒鑒別結果的影響

3.1.2 緩沖液pH 使用不同pH 緩沖液對僵蠶蛋白進行提取，分別設置緩沖液pH 為4、5、6。結果表明，緩沖液pH 為4～6 時，僵蠶藥材、飲片、標準湯劑凍干粉、提取物、配方顆粒均能出現(xiàn)目的條帶；當緩沖液pH=5時，僵蠶各樣品的目的條帶比緩沖液pH=4條件下更清晰，比緩沖液pH=6條件下的提取分離效果更好，因此，選擇緩沖液pH=5（圖2）。

圖2 緩沖液pH對僵蠶配方顆粒鑒別結果的影響

3.2 料液比

分別對料液比1∶10、1∶20、1∶40 進行考察，結果表明，當料液比為1∶10時，僵蠶各樣品的目的條帶比其他條件下的更清晰且豐度最高，因此選擇料液比1∶10為蛋白提取溶劑的最適料液比（圖3）。

圖3 料液比對僵蠶配方顆粒鑒別結果的影響

3.3 振蕩溫度

采用不同振蕩溫度對僵蠶蛋白進行提取，分別設置溫度為30、40、50、60 ℃。結果表明，隨著溫度的提高樣品條帶亮度逐漸變弱。當振蕩溫度為30 ℃時，僵蠶各樣品的目的條帶比其他條件下的更清晰且豐度更高，因此選擇僵蠶蛋白提取溫度為30 ℃（圖4）。

圖4 振蕩溫度對僵蠶配方顆粒鑒別結果的影響

3.4 振蕩時間

分別選用1.5、3.0、6.0、12.0 h對僵蠶蛋白進行提取，結果表明經1.5～12.0 h 緩沖液振蕩提取均能獲得目標蛋白，且條帶清晰?？紤]實驗操作的便捷性，選擇振蕩1.5 h作為提取時間（圖5）。

圖5 振蕩時間對僵蠶配方顆粒鑒別結果的影響

3.5 上樣量

對已制備完成的蛋白電泳樣品，分別取樣品2、4、8、16 μL 進行上樣，結果表明，樣品上樣量為2～16 μL，均能呈現(xiàn)較清晰的條帶；當上樣量為4 μL時各泳道樣品條帶清晰且互不影響，因此選擇4 μL為樣品上樣量（圖6）。

圖6 上樣量對僵蠶配方顆粒鑒別結果的影響

3.6 專屬性

根據以上結果，確定僵蠶配方顆粒蛋白提取的條件為取適量僵蠶對照藥材樣品，按料液比1∶10加入0.1 mol·L-1乙酸鈉緩沖液（pH=5），30 ℃振蕩提取1.5 h，電泳樣品上樣量為4 μL。

使用該方法對僵蠶對照藥材及其混偽品進行鑒定，僵蠶對照藥材能擴增出特異性條帶，混偽品均無條帶，表明所建立的僵蠶配方顆粒SDS-PAGE 鑒別方法具有很好的專屬性（圖7）。

圖7 使用僵蠶配方顆粒鑒別方法鑒別僵蠶混偽品

3.7 適用性

使用該方法對18 批僵蠶藥材、18 批僵蠶飲片、18批配方顆粒標準湯劑、3批提取物和3批配方顆粒進行鑒別，以驗證方法的適用性。結果表明，所有樣本蛋白供試品與僵蠶對照藥材的電泳圖譜在40～50 kDa相應的位置上均有1條蛋白條帶（圖8）。

圖8 僵蠶配方顆粒適用性考察

3.8 僵蠶特征蛋白的分析鑒定

對40～50 kDa目標條帶進行蛋白提取及酶解，并利用LC-MS/MS 對回收產物進行鑒定（圖9），使用UniProt 中Beauveria bassiana和Bombyx mori的 蛋白組作為參考數(shù)據庫。結果表明該產物中含有僵蠶基原動物家蠶的抗糜蛋白酶、抗胰蛋白酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑絲蛋白、絲膠等，相對定量值排名前10 的蛋白見表3，其中主要成分Serpin類絲氨酸蛋白酶抑制蛋白、抗糜蛋白和抗胰蛋白總量約占7.58%、36.98%、9.63%，3 類蛋白占該條帶總蛋白的54.20%，可代表該鑒別條帶。Serpin 類絲氨酸蛋白酶抑制劑作為僵蠶的特異性蛋白在僵蠶藥材和提取物中含量較穩(wěn)定，可作為僵蠶鑒別的蛋白標記。

圖9 僵蠶樣品總離子流色譜圖及定性肽段二級質譜

表3 僵蠶藥材和僵蠶提取物質譜鑒定和檢索結果

4 結語

《中華人民共和國藥典》2020年版（一部）共收載了51 味動物藥，多采用顯微鑒別、化學鑒別和含量測定方法進行質量控制[19]。當前僵蠶鑒定研究主要針對藥材[2-4,20-21]，對于經加工處理后的僵蠶制品，如提取物、配方顆粒等仍缺少準確、簡便、快速的鑒定方法。本研究通過SDS-PAGE，優(yōu)化了蛋白提取條件，篩選適合的緩沖液pH、料液比、提取溫度、振蕩時間，用于分離不同加工方式僵蠶樣品的蛋白。在此基礎上，建立了僵蠶配方顆粒SDS-PAGE 鑒別方法，并對其鑒別專屬性及適應性進行了分析。同時利用LC-MS/MS 分析對僵蠶配方顆粒的蛋白標志物進行篩選。SDS-PAGE分離出的僵蠶配方顆粒特征性條帶為40～50 kDa，該條帶主要含有僵蠶基原動物家蠶的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白、抗糜蛋白和抗胰蛋白，其可作為僵蠶鑒別的蛋白標記。利用LC-MS/MS 分析結果也可進一步區(qū)分家蠶和感染白僵菌的家蠶。

其中，絲氨酸蛋白酶抑制劑在動植物及微生物體內廣泛存在，根據其序列同源性和作用機制可將其分為經典類、非經典類、Serpin類[22]，在植物、動物、微生物中其氨基酸長度、序列和結構存在一定差別[23-26]，可作為物種鑒別的標記。結合SDS-PAGE分析條帶的相對分子質量大小、特征性蛋白在僵蠶藥材和提取物中的特異性和穩(wěn)定程度，可將絲氨酸蛋白酶抑制蛋白Serpin-2 作為僵蠶配方顆粒的特異性蛋白。

采用所建立的SDS-PAGE 對多批僵蠶藥材、提取物、配方顆粒等進行檢驗，結果顯示，所檢測的63 批樣品電泳譜圖均在40～50 kDa 出現(xiàn)特異性條帶，表明本研究建立的僵蠶SDS-PAGE鑒別方法對藥材、提取物、配方顆粒均具有良好的適用性，可為僵蠶藥材及相關加工品檢測提供新的方法，可為完善僵蠶質量控制體系、保障臨床應用提供參考。