俞 蕙

復旦大學附屬兒科醫(yī)院感染傳染科（上海 201102）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA)又稱綠膿桿菌，屬于假單胞菌屬，革蘭陰性桿菌，是導致免疫力低下的住院患者和囊性纖維化患者感染的主要原因。近年來隨著碳青霉烯類抗生素廣泛用于控制PA 嚴重感染，以及PA 復雜的耐藥機制，碳青霉烯類耐藥銅綠假單孢菌(carbapenem resistantPseudomonas aeruginosa，CRPA) 已開始大規(guī)模出現(xiàn)，世界衛(wèi)生組織(WHO)在2017年將CRPA列為急需開發(fā)新型抗生素治療其感染的三種細菌之一[1]，以突出其在臨床上的嚴峻形勢。兒童免疫力低下，細菌感染導致的危害更為嚴重，因此充分了解CRPA的耐藥機制及治療現(xiàn)狀，加強對CRPA 的管理尤為重要。

1 CRPA在兒童群體中的流行現(xiàn)狀

根據(jù)中國兒童細菌耐藥監(jiān)測組（The Infectious Disease Surveillance of Pediatrics，ISPED）對兒童細菌耐藥的監(jiān)測數(shù)據(jù)[2]，雖然PA 對美羅培南的耐藥率呈下降趨勢（從2016 年的15.8%下降至2020 年的6.1%），但在美國兒童群體中，CRPA 的比例從1999年的9.4%增加到2012年的20%[3]，在歐洲兒科患者中，從2004—2012年到2013—2018年，PA對碳青霉烯類抗生素的耐藥率顯著增加（從9.1%到12.4%）[4]。

2 PA對碳青霉烯類藥物的耐藥機制

PA 對抗生素產生耐藥的主要機制可分為內在性、獲得性和適應性。內在性耐藥機制指細菌通過自身固有的結構和功能對抗生素產生耐藥[5]，包括外膜通透性降低、外排泵過度表達、產生抗生素滅活酶。獲得性耐藥機制指細菌通過遺傳元件的水平轉移和基因變異獲得抗生素耐藥性。適應性耐藥機制是指細菌在抗生素或其他環(huán)境因素的刺激下某些基因和/或蛋白的暫時改變，且這種改變是可逆的，主要指生物膜的形成。

2.1 內在性耐藥機制

2.1.1 外膜通透性降低 革蘭陰性桿菌的外膜是由磷脂和脂多糖構成的不對稱雙分子層，雖可選擇性防止抗生素穿透，但抗生素仍可通過內嵌的孔道蛋白進入細菌?？椎赖鞍字饕? 類：非特異性孔蛋白，允許小的親水性分子緩慢擴散；特定孔蛋白，具有結合特定分子的特定位點；門控孔蛋白，是離子調節(jié)的外膜蛋白，負責攝取離子復合物；外排孔蛋白，外排泵的重要組成部分。在PA中，OprF蛋白是主要的非特異性孔蛋白；特定孔蛋白主要包括OprB、OprD、OprE、OprO和OprP；OprC和OprH屬于門控孔蛋白類；外排孔蛋白包括OprM、OprN 和OprJ[6]。導致PA對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要包括OprD 和外排孔蛋白，OprD 含有碳青霉烯類抗生素的結合位點，其缺乏會導致其對碳青霉烯類抗生素，特別是亞胺培南產生耐藥性[7]。關于外排孔蛋白將在外排泵過度表達部分展開。

2.1.2 外排泵過表達 細菌可以通過外排泵系統(tǒng)將進入胞內的抗菌藥物泵出胞外，從而使菌體內藥物濃度降低而導致耐藥。外排泵系統(tǒng)主要包括RND 家族、MFS 超家族、ABC 超家族、SMR 家族、MATE 家族。與PA 耐藥性相關的主要是RND 家族，其由內膜蛋白、連接蛋白、外膜蛋白（即外排孔蛋白）組成[8]。PA共表達12個RND系列外排泵，其中4個（MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM）與其耐藥性密切相關[9]。MexABOprM過表達導致PA對美羅培南耐藥，報道往往顯示MexAB-OprM過表達和OprD缺乏相結合使PA對碳青霉烯類抗生素均產生高度耐藥性。Hassuna等[10]檢測到634株CRPA中MexCD-OprJ、MexXY-OprM的表達率分別為75%、62%，顯示PA對美羅培南和亞胺培南的耐藥率與MexXY-OprM和MexCD-OprJ外排泵表達呈高度正相關。

2.1.3 抗生素滅活酶的產生 許多抗生素具有易于水解的化學鍵，而細菌產生的可以水解或修飾這些抗生素內在結構使之失活的滅活酶正是細菌內在耐藥性的重要組成部分。CRPA 產生的抗生素滅活酶主要是碳青霉烯酶，分布在A、B、D類β-內酰胺酶中。B類金屬酶主要包括IMP、VIM、NDM、SPM、GIM、FIM、SIM、DIM 等類型。其中，IMP、VIM 和NDM-1 是導致對所有碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因，而有關VIM-2的報道最頻繁。在A類β-內酰胺酶中，最常見的是KPC型碳青霉烯酶及GES型碳青霉烯酶。而D類β-內酰胺酶中，文獻報道的包括OXA-40、OXA-48、OXA-181和OXA-198[11]。在一項全球前瞻性隊列研究中，972株CRPA分離株中211 株(22%)檢出碳青霉烯酶基因，其中blaKPC-2最為常見，在83 株菌(39%的產碳青霉烯酶CRPA 分離株)中作為唯一的碳青霉烯酶基因，在20株菌(9%的產碳青霉烯酶CRPA分離株)中與blaVIM-2同時存在。52株菌(25%產碳青霉烯酶的CRPA菌株)唯一碳青霉烯酶基因為blaVIM-2。其他常見的碳青霉烯酶基因有blaNDM-1、blaIMP-1和blaGES-5。只有1 株菌含有D 類碳青霉烯酶基因(blaOXA-23)[12]。此外尚有新型碳青霉烯酶不斷出現(xiàn)，如Schauer 等[13]報道的新型A 類碳青霉烯酶GPC-1，這也為臨床診斷識別和治療不斷帶來新的挑戰(zhàn)。

除了碳青霉烯酶，Ampc 酶在PA 對碳青霉烯類抗生素產生耐藥中同樣發(fā)揮重大作用，Yin 等[14]對141株碳青霉烯類抗生素耐藥的PA進行基因分析時，96株(68.09%)AmpC過表達，12株(8.51%)菌株表現(xiàn)為臨界性增加，表明在Ampc 酶的高產量同樣會導致此類耐藥產生。

2.2 獲得性耐藥機制

2.2.1 水平基因轉移 抗生素耐藥基因可以攜帶在質粒、轉座子、整合子和前噬菌體上，細菌可以通過水平基因轉移從相同或不同的細菌物種獲得這些基因[15]。上文所述的主要碳青霉烯酶的基因都是由遺傳元件攜帶的，包括整合子和質粒。在目前發(fā)現(xiàn)的6 種耐藥相關整合子中，Ⅰ類整合子因攜帶耐藥基因繁多而被廣泛關注。PA 中，除了blaSPM-1、blaNDM-1和blaKPC-2，大多數(shù)獲得性碳青霉烯酶存在于Tn402類轉座子的I類整合子上，且大多數(shù)攜帶碳青霉烯酶基因的整合子都含有介導對其他抗生素耐藥的基因盒，導致CRPA 菌株的產生[16]。目前已報道多種在PA發(fā)現(xiàn)的攜帶碳青霉烯酶基因的相關質粒，如攜帶blaVIM-2的質粒pJB12[17]和質粒pS04 90[18]、攜帶blaIMP-9的質粒pOZ 176[19]等。碳青霉烯酶與整合子和質粒之間的密切關聯(lián)，使耐藥性得以快速傳播。

2.2.2 基因變異 PA能夠通過染色體突變對所有類別的抗生素產生耐藥性，突變可以導致抗生素靶標的修飾、外膜通透性降低、外排泵過表達以及抗生素滅活酶的過度產生，從而導致細菌耐藥性獲得或增加。在慢性囊性纖維化患者中，患者通常感染抗生素敏感的PA分離株，該分離株在長期感染和治療過程中會產生耐藥性，導致病情惡化[20]。

2.3 適應性耐藥機制——生物膜形成

生物膜介導的耐藥機制包括形成胞外屏障導致抗生素穿透性差、胞外微環(huán)境改變導致生物膜中的細胞營養(yǎng)限制和生長緩慢、誘導適應性應激反應和持留菌（persistent cell）的形成[21]。持留菌形成是一種抗生素存在下的表型變異，沒有耐藥基因，但卻對高濃度抗生素有耐受性。其處于關閉抗生素靶標合成通路的休眠狀態(tài)，可以躲避抗生素的殺傷作用，并在移除抗生素后重新繁殖形成生物膜，是PA慢性感染遷延不愈的主要原因[22]。PA 生物膜的形成受多因素調控，包括群體感應系統(tǒng)、Gacs/GacA和RetS/LadS 雙組分調控系統(tǒng)（TCS）、胞外多糖和cdi-GMP[23]。群體感應是細菌之間的信號傳遞機制，細菌通過分泌信號分子感應周圍環(huán)境中同類細菌的群體密度變動，當信號分子的濃度達到一定閾值就會啟動菌體內相關基因的表達，改變生理特性，控制生物膜形成的速率和范圍。PA擁有3個主要的群體感應系統(tǒng)：LasI-LasR、RhlI-RhlR和PQS-MvfR，所有這些系統(tǒng)都有助于生物膜的形成[22]。GacA是一種具有轉錄調控功能的反應調節(jié)因子，它控制編碼2個小的非編碼RNA——RsmY和RsmZ靶基因的表達，其高表達顯著促進生物膜的形成[24]。在gacs突變體中，缺乏這些sRNA 的表達會導致生物膜形成受損[25]。PA中，這兩個sRNA的表達受一個復雜調控網絡的控制，該網絡不僅涉及Gacs/GacA TCS，而且還涉及其他TCS途徑：RetS通過干擾Gacs/GacA TCS活性來抑制rsmY和rsmZ基因的表達；PA1611通過抵消RetS對GACS的干擾效應，誘導這兩個基因的表達；LsdS已被證明能激活rsmZ基因的表達[24]。另外3種不同的胞外多糖（Psl、Pel 和藻酸鹽）在生物膜的形成和維持中也發(fā)揮著重要作用。環(huán)狀di-GMP（c-di-GMP）是細胞信號轉導中的第二信使，可以協(xié)調從活動性到靜止的“生活方式轉變”。目前已普遍認為在PA細胞中高濃度c-di-GMP與生物膜形成之間的相關性[26]。對這些調控生物膜形成因素的深入認識有助于對CRPA 耐藥機制的進一步認識，并為研制新型藥物開發(fā)新思路。

3 CRPA的治療現(xiàn)狀

目前針對CRPA感染的治療藥物選擇較為有限，大多推薦采用新型β內酰胺類抗生素或聯(lián)合用藥方案治療。2022年美國感染病學會對難治性耐藥PA感染的治療指導[27]指出：治療對碳青霉烯類藥物不敏感但對傳統(tǒng)β內酰胺類藥物敏感的PA引起的感染，建議選擇傳統(tǒng)β 內酰胺類藥物大劑量延長輸注時間，治療對碳青霉烯類耐藥但對傳統(tǒng)β內酰胺類藥物敏感的PA 引起的中重度感染或感染源控制不佳的患者，可使用新型β內酰胺類藥物（如頭孢洛扎-他唑巴坦、頭孢他啶-阿維巴坦、亞胺培南-西司他丁-雷利巴坦，若藥敏結果顯示敏感）。另外，如果對首選的新型β內酰胺類抗菌藥物體外藥敏顯示敏感，不推薦常規(guī)的聯(lián)合抗菌藥物治療CRPA 引起的感染，會增加抗菌藥物相關不良事件的可能性。但如果CRPA 對所有首選藥物均不敏感，可考慮一種敏感的氨基糖苷類聯(lián)合頭孢洛扎-他唑巴坦、頭孢他啶-阿維巴坦或亞胺培南-西司他丁-雷利巴坦，優(yōu)先選擇最小抑菌濃度最接近其敏感性臨界點的β內酰胺類-β 內酰胺酶抑制劑復方制劑。如果體外藥敏顯示對氨基糖苷類也均不敏感，可考慮多黏菌素B聯(lián)合β內酰胺類-β內酰胺酶抑制劑復方制劑?！吨袊~綠假單胞菌下呼吸道感染診治專家共識》[28]同樣指出，對于CRPA所致的肺部感染，若藥敏試驗顯示其對頭孢他啶/阿維巴坦、頭孢洛扎/他唑巴坦、亞胺培南-西司他丁/雷利巴坦、美羅培南/法硼巴坦等新型酶抑制劑復合制劑敏感，仍然選擇其作為一線選擇；二線治療可選擇頭孢地爾。在上述藥物不可及或者不能耐受的情況下，可考慮使用以多黏菌素類藥物為基礎的聯(lián)合治療（如具有抗PA活性的β內酰胺類、環(huán)丙沙星、磷霉素等）。不同的是，歐洲臨床微生物學和傳染病學會（ESCMID）治療耐多藥革蘭陰性桿菌感染的指南[29]提出，對于非重度感染或低風險CRPA 感染的患者，推薦使用傳統(tǒng)的具有體外抗菌活性的單藥治療，當發(fā)生嚴重感染時，可選用多黏菌素、氨基糖苷類或磷霉素中的兩種體外活性藥物聯(lián)合治療。

氨曲南是目前唯一對B 類金屬酶水解穩(wěn)定的β-內酰胺類藥物，由于作用于細菌細胞壁的不同靶位，將其與β-內酰胺酶抑制劑進行組合，于產碳青霉烯酶的耐藥革蘭陰性菌而言，是可予以期待的治療方案。已有研究報道成功使用氨曲南聯(lián)合頭孢他啶-阿維巴坦治愈僅對阿米卡星和黏菌素敏感的產NDM-1和AmpC高表達的PA感染肺炎患者的臨床案例[30]。目前我國指南中雙β 內酰胺類抗生素聯(lián)用的推薦方案中多包含氨曲南，如哌拉西林-他唑巴坦+氨曲南、頭孢他啶+氨曲南、頭孢吡肟+氨曲南[31]。

另外，2017年《廣泛耐藥革蘭陰性菌感染的實驗診斷、抗菌治療及醫(yī)院感染控制：中國專家共識》[31]也指出，感染控制不佳時可選用三藥聯(lián)合方案，如多黏菌素+β 內酰胺類+環(huán)丙沙星、多黏菌素+β 內酰胺類+磷霉素、多黏菌素靜脈滴注+碳青霉烯類+多黏菌素霧化吸入、氨曲南+頭孢他啶+阿米卡星。

在細菌耐藥已經成為臨床醫(yī)學、公共衛(wèi)生安全所關注的重點問題的背景下，PA對碳青霉烯類抗生素的耐藥問題日益突出，不僅耐藥機制繁多，而且大部分CRPA 的產生是由多種機制共同介導的，同時耐藥基因的轉移和變異也大大增加了耐藥性的快速傳播，為臨床識別和治療帶來巨大挑戰(zhàn)。新型β 內酰胺類抗生素的出現(xiàn)很大程度上解決了這一難題，但目前已有關于耐頭孢他啶-阿維巴坦等新型抗生素的PA出現(xiàn)的相關報道，因此新藥研發(fā)的腳步仍然不能停歇。