佘露露，王 蕾，蔣洪久，李朝云，玉光惠*

（仁懷醬香白酒科研所，貴州 遵義 564500）

醬香型白酒是我國(guó)重要的香型白酒之一，其中貴州茅臺(tái)酒是傳統(tǒng)工藝大曲醬香型白酒的典型代表，是與蘇格蘭威士忌、法國(guó)科涅克白蘭地齊名的世界三大蒸餾名酒之一。以手工操作為主的傳統(tǒng)工藝醬香型白酒的釀造因其獨(dú)特而復(fù)雜的釀造工藝、對(duì)釀造環(huán)境的苛刻要求和高度依賴性，形成了季節(jié)性生產(chǎn)、生產(chǎn)周期漫長(zhǎng)、生產(chǎn)成本高、出酒率低、多輪次高溫發(fā)酵以及多輪次蒸餾取酒等特點(diǎn)，造就了酒體幽雅細(xì)膩、醇厚，回味悠長(zhǎng)，空杯留香持久的風(fēng)格[1-3]。

目前，醬香型白酒生產(chǎn)仍以傳統(tǒng)工藝為主，相對(duì)傳統(tǒng)工藝而言，非傳統(tǒng)工藝中以碎沙工藝較常見(jiàn)，有部分翻沙工藝，也有少數(shù)企業(yè)在部分生產(chǎn)環(huán)節(jié)利用了機(jī)械化裝備生產(chǎn)[4-5]。非傳統(tǒng)工藝因其工藝操作簡(jiǎn)單，周期較短、生產(chǎn)成本較低、產(chǎn)量較高等特點(diǎn)，在降低企業(yè)生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)成本、滿足不同消費(fèi)層次需求上有一定的推動(dòng)作用。近年來(lái)，醬香型白酒市場(chǎng)需求日益擴(kuò)大，出現(xiàn)了以醬香型白酒生產(chǎn)丟棄的酒糟，加入食用酒精進(jìn)行串蒸取酒等生產(chǎn)的調(diào)香白酒來(lái)以次充好、摻雜使假，低質(zhì)高價(jià)、蒙騙消費(fèi)者，擾亂市場(chǎng)的現(xiàn)象。為維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益、引導(dǎo)企業(yè)誠(chéng)信經(jīng)營(yíng)、維護(hù)市場(chǎng)有序競(jìng)爭(zhēng)、維護(hù)醬香白酒產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，亟需建立快速有效的檢測(cè)方法用于不同工藝醬香型白酒的區(qū)分與鑒定，為打擊市場(chǎng)不良經(jīng)營(yíng)行為等提供參考依據(jù)。通常不同工藝酒體感官區(qū)別明顯，在區(qū)分傳統(tǒng)大曲醬香工藝白酒、非傳統(tǒng)醬香工藝白酒及酒精串蒸的調(diào)香白酒上，感官鑒評(píng)法在一定范圍內(nèi)可快速有效地識(shí)別酒體工藝和品質(zhì)，但由于感官的不穩(wěn)定性，以及上述工藝酒體混合勾調(diào)的多樣性，也存在一些不足和誤差，需儀器檢測(cè)結(jié)果輔助分析以提高鑒別準(zhǔn)確率。在檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)上，白酒鑒定利用色譜法或結(jié)合質(zhì)譜法建立白酒風(fēng)味物質(zhì)組分指紋圖譜進(jìn)行分析[6-9]，這些技術(shù)實(shí)現(xiàn)了白酒風(fēng)味物質(zhì)的定性、定量以及判別模型的鑒定，但在實(shí)際應(yīng)用上存在耗時(shí)長(zhǎng)、人員要求高、設(shè)備昂貴等不足，較難實(shí)現(xiàn)快速鑒別及應(yīng)用。

光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量法在快速鑒別上被廣泛應(yīng)用于酒類產(chǎn)品，如用于茅臺(tái)酒真?zhèn)舞b別[10]、古井貢酒年份酒鑒別[11]、白酒種類快速識(shí)別[12]、青稞酒種類判別[13]等。光譜法中的紫外光譜分析技術(shù)在食品領(lǐng)域的定性定量分析上具有儀器穩(wěn)定、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、設(shè)備便宜、操作簡(jiǎn)單和測(cè)定速度快等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)合紫外光譜技術(shù)與化學(xué)計(jì)量方法，以已知樣本光譜數(shù)據(jù)參數(shù)建立定量或定性模型，可實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本的預(yù)測(cè)。因此，本研究利用紫外光譜技術(shù)分析280批次具代表性的傳統(tǒng)工藝醬香輪次酒、成品酒、碎沙工藝醬香白酒及酒精串蒸調(diào)香白酒在近紫外區(qū)的吸光度值、光譜指紋特征及部分紫外光吸收物質(zhì)，應(yīng)用主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial leasts quares-discriminant analysis，PLS-DA）建立不同工藝醬香型白酒鑒別模型，以實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)大曲醬香工藝白酒與碎沙工藝醬香白酒、酒精串蒸調(diào)香白酒的快速鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同工藝醬香型白酒酒樣：項(xiàng)目參與企業(yè)提供及市場(chǎng)采購(gòu)，其中傳統(tǒng)工藝代表酒樣60批次（編號(hào)為T01～T60），碎沙工藝代表酒樣60批次（編號(hào)為S01～S60），串蒸調(diào)香酒樣20批次（編號(hào)為C01～C20），醬香1～7輪次酒樣20組（共140個(gè)），供試酒樣除輪次酒外，酒精度均為53%vol。

酯類、酸類、醇類及醛酮類標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞98%）、無(wú)水乙醇（色譜純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2700i紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；SK7200B超聲清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；Milli-QAA10超純水機(jī)：昆明倍捷科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取酒樣0.5 mL，超純水定容至10 mL，超聲振蕩5 min后，取適量樣品于石英比色皿中，以53%vol乙醇水溶液作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)190～350 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品制備

稱取適量酯類、酸類、醇類及醛酮類標(biāo)準(zhǔn)品，53%vol乙醇水溶液定容至10 mL為標(biāo)準(zhǔn)品母液，并將標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液分別稀釋至1 000 mg/L 和100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液及工作液。取適量樣品于石英比色皿中，以53%vol乙醇水溶液作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)190～350 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3.3 紫外光譜相似度

紫外光譜曲線相似度是樣品穩(wěn)定性和儀器穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)依據(jù)，當(dāng)兩樣品間的紫外相似度＞0.90時(shí)，可認(rèn)為這兩個(gè)樣品為同類樣品或同一批次樣品[14]。紫外光譜相似度計(jì)算公式如下：

其中S為兩光譜曲線的相似程度，n為光譜曲線的采樣點(diǎn)，h1、h2分別為兩光譜曲線同一采樣點(diǎn)的吸光度值。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

利用UVprobe2.6軟件提取原始光譜數(shù)據(jù)，通過(guò)Microsoft Excel 2019計(jì)算樣本光譜平均值和相似度，Origin Pro 2022和SIMCA 14進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化與模型建立。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜曲線相似度分析

紫外光譜曲線相似度既能反映樣品相似程度，又能反映二者差異。采集各代表酒樣紫外光譜數(shù)據(jù)，每個(gè)樣品3次平行，平行樣的光譜曲線基本重合，且紫外相似度均＞0.95；說(shuō)明醬香型白酒的光譜曲線重現(xiàn)性良好，具有較強(qiáng)的光譜穩(wěn)定性。不同工藝醬香型白酒樣品紫外光譜曲線特征的相似度比較結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，相同工藝不同樣品間的紫外相似度波動(dòng)較小，不同工藝樣品間的紫外相似度差異明顯。傳統(tǒng)工藝代表酒樣間的紫外相似度均＞0.85，且與碎沙工藝、調(diào)香白酒紫外相似度均＜0.75；而碎沙工藝和調(diào)香白酒樣品間的紫外相似度則在0.16～0.92之間波動(dòng)，說(shuō)明傳統(tǒng)工藝酒樣與碎沙工藝、調(diào)香白酒酒樣光譜曲線區(qū)別明顯。

表1 不同工藝醬香型白酒樣品紫外光譜曲線特征的相似度比較Table 1 Comparison of similarity of ultraviolet spectral curve characteristics of sauce-flavor Baijiu samples with different processes

2.2 醬香型白酒的紫外吸收光譜分析

2.2.1 醬香型輪次基酒的紫外光譜特征

傳統(tǒng)工藝醬香輪次基酒是勾調(diào)形成優(yōu)質(zhì)成品酒的基礎(chǔ)，各輪次基酒間的風(fēng)味物質(zhì)種類與含量是一個(gè)逐漸增加、積累后又隨之降低、減少的過(guò)程[15-16]。一至七輪次基酒的紫外吸收光譜曲線及各輪次酒在波長(zhǎng)277 nm處的吸光度值T檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1A和圖1B可知，一輪次和二輪次在波長(zhǎng)201～210 nm和277 nm處有最大吸收峰，波長(zhǎng)277 nm處的吸光度值依次為0.181～1.211、0.361～2.530；由圖1C和圖1G可知，三輪次、七輪次在波長(zhǎng)201～210 nm和277 nm處有最大吸收峰，波長(zhǎng)223～226 nm處有微弱吸收峰，波長(zhǎng)277 nm的吸光度值依次為1.248～2.939、0.643～2.634；圖1D、1E、1F 可知，四輪次、五輪次、六輪次在波長(zhǎng)201～210 nm、223～226 nm和277 nm處有最大吸收峰，波長(zhǎng)277 nm處的吸光度值依次為1.591～3.806、2.294～4.582、2.012～4.307。由圖1H可知，各輪次基酒間的紫外光譜吸光度值變化平均擬合曲線圖與輪次基酒風(fēng)味物質(zhì)含量變化類似，呈現(xiàn)出先增加后降低的特征。由圖1J可知，在波長(zhǎng)277 nm處，七個(gè)輪次基酒間的平均吸光度值依次為0.439、1.125、2.010、2.814、3.404、2.972、1.598，四輪次、五輪次、六輪次基酒顯著區(qū)別于其他輪次（P＜0.05），一輪次、二輪次基酒與其他輪次有顯著差異（P＜0.05），三輪次、七輪次基酒間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，不同企業(yè)相同輪次基酒的紫外吸收光譜具有一定差異，但輪次間的圖譜曲線變化特征類似。在波長(zhǎng)201～210 nm、223～226 nm及277 nm處，出現(xiàn)了明顯的紫外光吸收波峰，且前兩段波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收峰位置會(huì)因樣品的不同而產(chǎn)生位移現(xiàn)象，而在波長(zhǎng)277 nm處的波峰未因樣品差異而產(chǎn)生位移，可能與醬香白酒中酯類、醛酮類、酸類、芳香族或雜環(huán)類等多物質(zhì)間產(chǎn)生共軛作用有關(guān)[17]。

圖1 一至七輪次基酒的紫外吸收光譜曲線（A～H）及各輪次基酒在波長(zhǎng)277 nm處的吸光度值T檢驗(yàn)結(jié)果（J）Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum curves of the first to the seventh rounds of base liquor (A-H) and T test results (J) of absorbance of various round base liquor at 277 nm

2.2.2 不同工藝與調(diào)香白酒的紫外光譜特征

傳統(tǒng)工藝醬香型成品酒主要以七個(gè)輪次基酒按一定比例組合，其中以三至五輪次基酒用量占比較高，并加入不同酒齡、香型特征的調(diào)味酒勾調(diào)后，經(jīng)長(zhǎng)期貯存形成[3]。不同工藝醬香型白酒樣品紫外光譜及各醬香型白酒在波長(zhǎng)277 nm處吸光度值T檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同工藝醬香型白酒樣品的紫外光譜圖（A～C）及各醬香型白酒在波長(zhǎng)277 nm處的T檢驗(yàn)結(jié)果（D）Fig.2 Ultraviolet spectrum of sauce-flavor Baijiu samples with different processes (A-C) and T test results (D) of absorbance of various sauce-flavor Baijiu at 277 nm

由圖2A可知，傳統(tǒng)工藝醬香型成品酒的紫外吸收峰主要在波長(zhǎng)205～210 nm、223～228 nm及277 nm處，紫外光譜特征類似于三至六輪次基酒，與傳統(tǒng)工藝醬香型白酒以輪次酒為主體的勾調(diào)工藝一致。由圖2B和圖2C可知，碎沙工藝和調(diào)香白酒的紫外吸收?qǐng)D譜相似，均產(chǎn)生兩個(gè)吸收峰，分別為277 nm、205～210 nm。由圖2D可知，傳統(tǒng)工藝在波長(zhǎng)277 nm處的吸光度值明顯大于非傳統(tǒng)工藝，且存在極顯著差異（P＜0.01），而碎沙工藝和調(diào)香白酒之間的吸光度值則無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.2.3 醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的紫外光譜特征

醬香型白酒中已檢出超過(guò)1 800種組分，約占總量的1%～2%，這些微量組分是形成醬香風(fēng)格的重要組成部分[18]。為進(jìn)一步分析醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的紫外光譜特征，選取醬香型白酒中6種酯類、5種酸類、6種醇類及7種醛酮類物質(zhì)共計(jì)24種具代表性風(fēng)味組分，采集紫外光掃描特征圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3A可知，乙酸乙酯、丁酸己酯、己酸乙酯等酯類代表物質(zhì)的紫外吸收主要集中在200～240 nm，乳酸乙酯在200～240 nm和250～300 nm兩處波段間均有紫外吸收。由圖3B可知，乙酸、丁酸、己酸等酸類代表物質(zhì)的紫外吸收波段為200～240 nm。由圖3C可知，醛酮類代表物質(zhì)的紫外吸收帶變化范圍廣，如乙醛為200～240nm，異丁醛為250～330 nm，乙縮醛為200～245 nm和250～320 nm，2-戊酮、2-丁酮和2,3-丁二酮?jiǎng)t集中在230～330 nm。由圖3D可知，正丙醇、正丁醇、異戊醇等醇類代表物質(zhì)在200～350nm波長(zhǎng)范圍幾乎無(wú)紫外吸收，推測(cè)醇類物質(zhì)的吸收峰可能在波長(zhǎng)＜200 nm的極紫外區(qū)。糠醛是醬香型白酒中典型的羰基類物質(zhì)，含量一般在100～300 mg/L左右[19-21]。由圖3E可知，糠醛在190～200 nm，205～240 nm和240～310 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)均有吸收峰，最大吸收波長(zhǎng)為277 nm；稀釋20倍后，5 mg/L糠醛產(chǎn)生的紫外吸收光譜曲線和傳統(tǒng)工藝的紫外光譜曲線相似，且二者最大吸收波長(zhǎng)均為277 nm。

圖3 醬香型白酒中代表性風(fēng)味組分的紫外光譜圖Fig.3 Ultraviolet spectrum of representative flavor components in sauce-flavor Baijiu

由圖3A～3D可知，除糠醛外，100 mg/L各標(biāo)準(zhǔn)化合物的波峰吸光度值均＜0.15，而采集質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的8種醬香型白酒高含量物質(zhì)乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、乳酸、乙縮醛、2,3-丁二酮、正丙醇、異丁醇紫外光譜的結(jié)果表明，相應(yīng)組分的波長(zhǎng)吸光度值會(huì)隨濃度增加而升高，而未產(chǎn)生紫外吸收波段的吸光度值則不會(huì)隨之變化。綜上可知，醇類物質(zhì)在近紫外光區(qū)的吸收不完全，酸類、酯類和醛酮類組分是醬香型白酒在近紫外區(qū)產(chǎn)生吸收的物質(zhì)基礎(chǔ)，酸類、酯類主要在200～240 nm，醛酮類主要在240～310 nm；其中，糠醛是醬香型白酒在波長(zhǎng)277 nm處產(chǎn)生紫外吸收主要物質(zhì)，也是200～310 nm波段產(chǎn)生紫外吸收的重要貢獻(xiàn)物質(zhì)。

2.3 PCA和PLS-DA模型驗(yàn)證

PCA是通過(guò)識(shí)別數(shù)據(jù)中變化最大的方向即主成分來(lái)完成數(shù)據(jù)簡(jiǎn)化和降維的一種數(shù)學(xué)算法，并同時(shí)保留數(shù)據(jù)集中的大部分變化。通過(guò)使用幾個(gè)成分表示每個(gè)樣本數(shù)各變量的值來(lái)對(duì)樣本進(jìn)行繪制，從而直觀地評(píng)估樣本之間的相似性和差異性，并確定是否可以對(duì)樣本進(jìn)行分組[22]。醬香型白酒產(chǎn)生紫外吸收的波段主要為190～320 nm，其相應(yīng)的風(fēng)味組分的紫外吸收波段則為200～320 nm，而190～200 nm間的紫外吸收易受到乙醇及其他醇類物質(zhì)干擾，故選擇200～320 nm作為PCA和建立PLS-DA模型的波段。

對(duì)140個(gè)酒樣的原始光譜吸光度值采用無(wú)監(jiān)督的PCA和PLS-DA模型驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4A可知，傳統(tǒng)工藝（C）分別與碎沙工藝（S）、調(diào)香白酒（T）有顯著的區(qū)分，而碎沙工藝和調(diào)香白酒酒樣因其紫外光譜無(wú)顯著差異，故碎沙工藝和調(diào)香白酒聚集在同一側(cè)，且部分重疊。未在置信區(qū)間內(nèi)的樣品異常點(diǎn)，是由于醬香型白酒釀造工藝復(fù)雜，不同廠家的醬香型白酒風(fēng)味組分種類與含量存在差異導(dǎo)致的[23-24]。PC1和PC2方差貢獻(xiàn)率分別為93.7%和4.3%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)98.0%，說(shuō)明基于醬香型白酒的紫外吸光度值變化可以有效區(qū)別傳統(tǒng)工藝和非傳統(tǒng)工藝。

圖4 主成分分析（A）和偏最小二乘判別分析（B）模型驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 Results principal component analysis (A) and partial least squares-discriminant analysis (B) model verification

PLS-DA是基于偏最小二乘算法演變形成的判別分析模型，常用于樣本檢測(cè)指標(biāo)的標(biāo)志物篩選和樣本分類預(yù)測(cè)研究[25]。采取有監(jiān)督的PLS-DA建立傳統(tǒng)工藝的判別模型，選擇100個(gè)酒樣作為訓(xùn)練集，20個(gè)酒樣作為驗(yàn)證集，結(jié)果見(jiàn)圖4B和表2。由圖4B可知，基于傳統(tǒng)工藝的監(jiān)督，醬香型白酒的工藝可明顯分為兩類，其中傳統(tǒng)工藝主要聚集在第2、3象限，非傳統(tǒng)工藝主要聚集在第1、4象限。由表2可知，PLS-DA模型的測(cè)試集和驗(yàn)證集的擬合系數(shù)（R2Y）分別為0.782和0.801，交叉驗(yàn)證均方根誤差（root mean square error，RMSE）分別為0.237和0.242，模型沒(méi)有過(guò)度擬合；預(yù)測(cè)系數(shù)（Q2）為0.771和0.716，Q2＞0.5，模型的分類預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)，PLS-DA模型對(duì)工藝的分類識(shí)別判斷準(zhǔn)確率為100%，這些參數(shù)指標(biāo)說(shuō)明紫外光譜技術(shù)結(jié)合PLS-DA模型能快速準(zhǔn)確判斷醬香型白酒傳統(tǒng)工藝。

表2 偏最小二乘判別分析模型對(duì)傳統(tǒng)工藝與非傳統(tǒng)工藝的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率Table 2 Prediction accuracy of partial least squares discriminant analysis model for traditional and non-traditional processes

3 結(jié)論

本研究基于紫外光譜分析法的簡(jiǎn)捷、低成本、快速有效、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)不同工藝醬香型白酒酒體和串蒸的調(diào)香白酒進(jìn)行了紫外光譜檢測(cè)，構(gòu)建了醬香型白酒傳統(tǒng)工藝七個(gè)輪次基酒的紫外光譜曲線變化特征圖，對(duì)比分析了傳統(tǒng)工藝、碎沙工藝及調(diào)香白酒的紫外光譜特征圖譜，在200～320 nm的紫外吸光度區(qū)間建立了傳統(tǒng)工藝與非傳統(tǒng)工藝的PLS-DA預(yù)測(cè)模型。紫外光譜結(jié)合PLS-DA模型驗(yàn)證結(jié)果表明，該模型在傳統(tǒng)工藝和非傳統(tǒng)工藝酒體的識(shí)別分類上準(zhǔn)確率達(dá)到100%，證明了光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量法可建立快速評(píng)價(jià)體系。本研究為醬香型白酒傳統(tǒng)工藝輪次基酒的質(zhì)量控制和釀造工藝的快速鑒別提供參考依據(jù)，同時(shí)為感官鑒評(píng)法鑒別不同工藝醬香酒體提供有效的輔助和參考。