佘露露，王 蕾，蔣洪久，李朝云，玉光惠*

（仁懷醬香白酒科研所，貴州 遵義 564500）

醬香型白酒是我國(guó)重要的香型白酒之一，其中貴州茅臺(tái)酒是傳統(tǒng)工藝大曲醬香型白酒的典型代表，是與蘇格蘭威士忌、法國(guó)科涅克白蘭地齊名的世界三大蒸餾名酒之一。以手工操作為主的傳統(tǒng)工藝醬香型白酒的釀造因其獨(dú)特而復(fù)雜的釀造工藝、對(duì)釀造環(huán)境的苛刻要求和高度依賴(lài)性，形成了季節(jié)性生產(chǎn)、生產(chǎn)周期漫長(zhǎng)、生產(chǎn)成本高、出酒率低、多輪次高溫發(fā)酵以及多輪次蒸餾取酒等特點(diǎn)，造就了酒體幽雅細(xì)膩、醇厚，回味悠長(zhǎng)，空杯留香持久的風(fēng)格[1-3]。

目前，醬香型白酒生產(chǎn)仍以傳統(tǒng)工藝為主，相對(duì)傳統(tǒng)工藝而言，非傳統(tǒng)工藝中以碎沙工藝較常見(jiàn)，有部分翻沙工藝，也有少數(shù)企業(yè)在部分生產(chǎn)環(huán)節(jié)利用了機(jī)械化裝備生產(chǎn)[4-5]。非傳統(tǒng)工藝因其工藝操作簡(jiǎn)單，周期較短、生產(chǎn)成本較低、產(chǎn)量較高等特點(diǎn)，在降低企業(yè)生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)成本、滿(mǎn)足不同消費(fèi)層次需求上有一定的推動(dòng)作用。近年來(lái)，醬香型白酒市場(chǎng)需求日益擴(kuò)大，出現(xiàn)了以醬香型白酒生產(chǎn)丟棄的酒糟，加入食用酒精進(jìn)行串蒸取酒等生產(chǎn)的調(diào)香白酒來(lái)以次充好、摻雜使假，低質(zhì)高價(jià)、蒙騙消費(fèi)者，擾亂市場(chǎng)的現(xiàn)象。為維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益、引導(dǎo)企業(yè)誠(chéng)信經(jīng)營(yíng)、維護(hù)市場(chǎng)有序競(jìng)爭(zhēng)、維護(hù)醬香白酒產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，亟需建立快速有效的檢測(cè)方法用于不同工藝醬香型白酒的區(qū)分與鑒定，為打擊市場(chǎng)不良經(jīng)營(yíng)行為等提供參考依據(jù)。通常不同工藝酒體感官區(qū)別明顯，在區(qū)分傳統(tǒng)大曲醬香工藝白酒、非傳統(tǒng)醬香工藝白酒及酒精串蒸的調(diào)香白酒上，感官鑒評(píng)法在一定范圍內(nèi)可快速有效地識(shí)別酒體工藝和品質(zhì)，但由于感官的不穩(wěn)定性，以及上述工藝酒體混合勾調(diào)的多樣性，也存在一些不足和誤差，需儀器檢測(cè)結(jié)果輔助分析以提高鑒別準(zhǔn)確率。在檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)上，白酒鑒定利用色譜法或結(jié)合質(zhì)譜法建立白酒風(fēng)味物質(zhì)組分指紋圖譜進(jìn)行分析[6-9]，這些技術(shù)實(shí)現(xiàn)了白酒風(fēng)味物質(zhì)的定性、定量以及判別模型的鑒定，但在實(shí)際應(yīng)用上存在耗時(shí)長(zhǎng)、人員要求高、設(shè)備昂貴等不足，較難實(shí)現(xiàn)快速鑒別及應(yīng)用。

光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量法在快速鑒別上被廣泛應(yīng)用于酒類(lèi)產(chǎn)品，如用于茅臺(tái)酒真?zhèn)舞b別[10]、古井貢酒年份酒鑒別[11]、白酒種類(lèi)快速識(shí)別[12]、青稞酒種類(lèi)判別[13]等。光譜法中的紫外光譜分析技術(shù)在食品領(lǐng)域的定性定量分析上具有儀器穩(wěn)定、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、設(shè)備便宜、操作簡(jiǎn)單和測(cè)定速度快等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)合紫外光譜技術(shù)與化學(xué)計(jì)量方法，以已知樣本光譜數(shù)據(jù)參數(shù)建立定量或定性模型，可實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本的預(yù)測(cè)。因此，本研究利用紫外光譜技術(shù)分析280批次具代表性的傳統(tǒng)工藝醬香輪次酒、成品酒、碎沙工藝醬香白酒及酒精串蒸調(diào)香白酒在近紫外區(qū)的吸光度值、光譜指紋特征及部分紫外光吸收物質(zhì)，應(yīng)用主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial leasts quares-discriminant analysis，PLS-DA）建立不同工藝醬香型白酒鑒別模型，以實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)大曲醬香工藝白酒與碎沙工藝醬香白酒、酒精串蒸調(diào)香白酒的快速鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同工藝醬香型白酒酒樣：項(xiàng)目參與企業(yè)提供及市場(chǎng)采購(gòu)，其中傳統(tǒng)工藝代表酒樣60批次（編號(hào)為T(mén)01～T60），碎沙工藝代表酒樣60批次（編號(hào)為S01～S60），串蒸調(diào)香酒樣20批次（編號(hào)為C01～C20），醬香1～7輪次酒樣20組（共140個(gè)），供試酒樣除輪次酒外，酒精度均為53%vol。

酯類(lèi)、酸類(lèi)、醇類(lèi)及醛酮類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞98%）、無(wú)水乙醇（色譜純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2700i紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；SK7200B超聲清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；Milli-QAA10超純水機(jī)：昆明倍捷科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取酒樣0.5 mL，超純水定容至10 mL，超聲振蕩5 min后，取適量樣品于石英比色皿中，以53%vol乙醇水溶液作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)190～350 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品制備

稱(chēng)取適量酯類(lèi)、酸類(lèi)、醇類(lèi)及醛酮類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品，53%vol乙醇水溶液定容至10 mL為標(biāo)準(zhǔn)品母液，并將標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液分別稀釋至1 000 mg/L 和100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液及工作液。取適量樣品于石英比色皿中，以53%vol乙醇水溶液作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)190～350 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3.3 紫外光譜相似度

紫外光譜曲線(xiàn)相似度是樣品穩(wěn)定性和儀器穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)依據(jù)，當(dāng)兩樣品間的紫外相似度＞0.90時(shí)，可認(rèn)為這兩個(gè)樣品為同類(lèi)樣品或同一批次樣品[14]。紫外光譜相似度計(jì)算公式如下：

其中S為兩光譜曲線(xiàn)的相似程度，n為光譜曲線(xiàn)的采樣點(diǎn)，h1、h2分別為兩光譜曲線(xiàn)同一采樣點(diǎn)的吸光度值。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

利用UVprobe2.6軟件提取原始光譜數(shù)據(jù)，通過(guò)Microsoft Excel 2019計(jì)算樣本光譜平均值和相似度，Origin Pro 2022和SIMCA 14進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化與模型建立。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜曲線(xiàn)相似度分析

紫外光譜曲線(xiàn)相似度既能反映樣品相似程度，又能反映二者差異。采集各代表酒樣紫外光譜數(shù)據(jù)，每個(gè)樣品3次平行，平行樣的光譜曲線(xiàn)基本重合，且紫外相似度均＞0.95；說(shuō)明醬香型白酒的光譜曲線(xiàn)重現(xiàn)性良好，具有較強(qiáng)的光譜穩(wěn)定性。不同工藝醬香型白酒樣品紫外光譜曲線(xiàn)特征的相似度比較結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，相同工藝不同樣品間的紫外相似度波動(dòng)較小，不同工藝樣品間的紫外相似度差異明顯。傳統(tǒng)工藝代表酒樣間的紫外相似度均＞0.85，且與碎沙工藝、調(diào)香白酒紫外相似度均＜0.75；而碎沙工藝和調(diào)香白酒樣品間的紫外相似度則在0.16～0.92之間波動(dòng)，說(shuō)明傳統(tǒng)工藝酒樣與碎沙工藝、調(diào)香白酒酒樣光譜曲線(xiàn)區(qū)別明顯。

表1 不同工藝醬香型白酒樣品紫外光譜曲線(xiàn)特征的相似度比較Table 1 Comparison of similarity of ultraviolet spectral curve characteristics of sauce-flavor Baijiu samples with different processes

2.2 醬香型白酒的紫外吸收光譜分析

2.2.1 醬香型輪次基酒的紫外光譜特征

傳統(tǒng)工藝醬香輪次基酒是勾調(diào)形成優(yōu)質(zhì)成品酒的基礎(chǔ)，各輪次基酒間的風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)與含量是一個(gè)逐漸增加、積累后又隨之降低、減少的過(guò)程[15-16]。一至七輪次基酒的紫外吸收光譜曲線(xiàn)及各輪次酒在波長(zhǎng)277 nm處的吸光度值T檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1A和圖1B可知，一輪次和二輪次在波長(zhǎng)201～210 nm和277 nm處有最大吸收峰，波長(zhǎng)277 nm處的吸光度值依次為0.181～1.211、0.361～2.530；由圖1C和圖1G可知，三輪次、七輪次在波長(zhǎng)201～210 nm和277 nm處有最大吸收峰，波長(zhǎng)223～226 nm處有微弱吸收峰，波長(zhǎng)277 nm的吸光度值依次為1.248～2.939、0.643～2.634；圖1D、1E、1F 可知，四輪次、五輪次、六輪次在波長(zhǎng)201～210 nm、223～226 nm和277 nm處有最大吸收峰，波長(zhǎng)277 nm處的吸光度值依次為1.591～3.806、2.294～4.582、2.012～4.307。由圖1H可知，各輪次基酒間的紫外光譜吸光度值變化平均擬合曲線(xiàn)圖與輪次基酒風(fēng)味物質(zhì)含量變化類(lèi)似，呈現(xiàn)出先增加后降低的特征。由圖1J可知，在波長(zhǎng)277 nm處，七個(gè)輪次基酒間的平均吸光度值依次為0.439、1.125、2.010、2.814、3.404、2.972、1.598，四輪次、五輪次、六輪次基酒顯著區(qū)別于其他輪次（P＜0.05），一輪次、二輪次基酒與其他輪次有顯著差異（P＜0.05），三輪次、七輪次基酒間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，不同企業(yè)相同輪次基酒的紫外吸收光譜具有一定差異，但輪次間的圖譜曲線(xiàn)變化特征類(lèi)似。在波長(zhǎng)201～210 nm、223～226 nm及277 nm處，出現(xiàn)了明顯的紫外光吸收波峰，且前兩段波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收峰位置會(huì)因樣品的不同而產(chǎn)生位移現(xiàn)象，而在波長(zhǎng)277 nm處的波峰未因樣品差異而產(chǎn)生位移，可能與醬香白酒中酯類(lèi)、醛酮類(lèi)、酸類(lèi)、芳香族或雜環(huán)類(lèi)等多物質(zhì)間產(chǎn)生共軛作用有關(guān)[17]。

圖1 一至七輪次基酒的紫外吸收光譜曲線(xiàn)（A～H）及各輪次基酒在波長(zhǎng)277 nm處的吸光度值T檢驗(yàn)結(jié)果（J）Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum curves of the first to the seventh rounds of base liquor (A-H) and T test results (J) of absorbance of various round base liquor at 277 nm

2.2.2 不同工藝與調(diào)香白酒的紫外光譜特征

傳統(tǒng)工藝醬香型成品酒主要以七個(gè)輪次基酒按一定比例組合，其中以三至五輪次基酒用量占比較高，并加入不同酒齡、香型特征的調(diào)味酒勾調(diào)后，經(jīng)長(zhǎng)期貯存形成[3]。不同工藝醬香型白酒樣品紫外光譜及各醬香型白酒在波長(zhǎng)277 nm處吸光度值T檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同工藝醬香型白酒樣品的紫外光譜圖（A～C）及各醬香型白酒在波長(zhǎng)277 nm處的T檢驗(yàn)結(jié)果（D）Fig.2 Ultraviolet spectrum of sauce-flavor Baijiu samples with different processes (A-C) and T test results (D) of absorbance of various sauce-flavor Baijiu at 277 nm

由圖2A可知，傳統(tǒng)工藝醬香型成品酒的紫外吸收峰主要在波長(zhǎng)205～210 nm、223～228 nm及277 nm處，紫外光譜特征類(lèi)似于三至六輪次基酒，與傳統(tǒng)工藝醬香型白酒以輪次酒為主體的勾調(diào)工藝一致。由圖2B和圖2C可知，碎沙工藝和調(diào)香白酒的紫外吸收?qǐng)D譜相似，均產(chǎn)生兩個(gè)吸收峰，分別為277 nm、205～210 nm。由圖2D可知，傳統(tǒng)工藝在波長(zhǎng)277 nm處的吸光度值明顯大于非傳統(tǒng)工藝，且存在極顯著差異（P＜0.01），而碎沙工藝和調(diào)香白酒之間的吸光度值則無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.2.3 醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的紫外光譜特征

醬香型白酒中已檢出超過(guò)1 800種組分，約占總量的1%～2%，這些微量組分是形成醬香風(fēng)格的重要組成部分[18]。為進(jìn)一步分析醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的紫外光譜特征，選取醬香型白酒中6種酯類(lèi)、5種酸類(lèi)、6種醇類(lèi)及7種醛酮類(lèi)物質(zhì)共計(jì)24種具代表性風(fēng)味組分，采集紫外光掃描特征圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3A可知，乙酸乙酯、丁酸己酯、己酸乙酯等酯類(lèi)代表物質(zhì)的紫外吸收主要集中在200～240 nm，乳酸乙酯在200～240 nm和250～300 nm兩處波段間均有紫外吸收。由圖3B可知，乙酸、丁酸、己酸等酸類(lèi)代表物質(zhì)的紫外吸收波段為200～240 nm。由圖3C可知，醛酮類(lèi)代表物質(zhì)的紫外吸收帶變化范圍廣，如乙醛為200～240nm，異丁醛為250～330 nm，乙縮醛為200～245 nm和250～320 nm，2-戊酮、2-丁酮和2,3-丁二酮?jiǎng)t集中在230～330 nm。由圖3D可知，正丙醇、正丁醇、異戊醇等醇類(lèi)代表物質(zhì)在200～350nm波長(zhǎng)范圍幾乎無(wú)紫外吸收，推測(cè)醇類(lèi)物質(zhì)的吸收峰可能在波長(zhǎng)＜200 nm的極紫外區(qū)?？啡┦轻u香型白酒中典型的羰基類(lèi)物質(zhì)，含量一般在100～300 mg/L左右[19-21]。由圖3E可知，糠醛在190～200 nm，205～240 nm和240～310 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)均有吸收峰，最大吸收波長(zhǎng)為277 nm；稀釋20倍后，5 mg/L糠醛產(chǎn)生的紫外吸收光譜曲線(xiàn)和傳統(tǒng)工藝的紫外光譜曲線(xiàn)相似，且二者最大吸收波長(zhǎng)均為277 nm。

圖3 醬香型白酒中代表性風(fēng)味組分的紫外光譜圖Fig.3 Ultraviolet spectrum of representative flavor components in sauce-flavor Baijiu

由圖3A～3D可知，除糠醛外，100 mg/L各標(biāo)準(zhǔn)化合物的波峰吸光度值均＜0.15，而采集質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的8種醬香型白酒高含量物質(zhì)乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、乳酸、乙縮醛、2,3-丁二酮、正丙醇、異丁醇紫外光譜的結(jié)果表明，相應(yīng)組分的波長(zhǎng)吸光度值會(huì)隨濃度增加而升高，而未產(chǎn)生紫外吸收波段的吸光度值則不會(huì)隨之變化。綜上可知，醇類(lèi)物質(zhì)在近紫外光區(qū)的吸收不完全，酸類(lèi)、酯類(lèi)和醛酮類(lèi)組分是醬香型白酒在近紫外區(qū)產(chǎn)生吸收的物質(zhì)基礎(chǔ)，酸類(lèi)、酯類(lèi)主要在200～240 nm，醛酮類(lèi)主要在240～310 nm；其中，糠醛是醬香型白酒在波長(zhǎng)277 nm處產(chǎn)生紫外吸收主要物質(zhì)，也是200～310 nm波段產(chǎn)生紫外吸收的重要貢獻(xiàn)物質(zhì)。

2.3 PCA和PLS-DA模型驗(yàn)證

PCA是通過(guò)識(shí)別數(shù)據(jù)中變化最大的方向即主成分來(lái)完成數(shù)據(jù)簡(jiǎn)化和降維的一種數(shù)學(xué)算法，并同時(shí)保留數(shù)據(jù)集中的大部分變化。通過(guò)使用幾個(gè)成分表示每個(gè)樣本數(shù)各變量的值來(lái)對(duì)樣本進(jìn)行繪制，從而直觀(guān)地評(píng)估樣本之間的相似性和差異性，并確定是否可以對(duì)樣本進(jìn)行分組[22]。醬香型白酒產(chǎn)生紫外吸收的波段主要為190～320 nm，其相應(yīng)的風(fēng)味組分的紫外吸收波段則為200～320 nm，而190～200 nm間的紫外吸收易受到乙醇及其他醇類(lèi)物質(zhì)干擾，故選擇200～320 nm作為PCA和建立PLS-DA模型的波段。

對(duì)140個(gè)酒樣的原始光譜吸光度值采用無(wú)監(jiān)督的PCA和PLS-DA模型驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4A可知，傳統(tǒng)工藝（C）分別與碎沙工藝（S）、調(diào)香白酒（T）有顯著的區(qū)分，而碎沙工藝和調(diào)香白酒酒樣因其紫外光譜無(wú)顯著差異，故碎沙工藝和調(diào)香白酒聚集在同一側(cè)，且部分重疊。未在置信區(qū)間內(nèi)的樣品異常點(diǎn)，是由于醬香型白酒釀造工藝復(fù)雜，不同廠(chǎng)家的醬香型白酒風(fēng)味組分種類(lèi)與含量存在差異導(dǎo)致的[23-24]。PC1和PC2方差貢獻(xiàn)率分別為93.7%和4.3%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)98.0%，說(shuō)明基于醬香型白酒的紫外吸光度值變化可以有效區(qū)別傳統(tǒng)工藝和非傳統(tǒng)工藝。

圖4 主成分分析（A）和偏最小二乘判別分析（B）模型驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 Results principal component analysis (A) and partial least squares-discriminant analysis (B) model verification

PLS-DA是基于偏最小二乘算法演變形成的判別分析模型，常用于樣本檢測(cè)指標(biāo)的標(biāo)志物篩選和樣本分類(lèi)預(yù)測(cè)研究[25]。采取有監(jiān)督的PLS-DA建立傳統(tǒng)工藝的判別模型，選擇100個(gè)酒樣作為訓(xùn)練集，20個(gè)酒樣作為驗(yàn)證集，結(jié)果見(jiàn)圖4B和表2。由圖4B可知，基于傳統(tǒng)工藝的監(jiān)督，醬香型白酒的工藝可明顯分為兩類(lèi)，其中傳統(tǒng)工藝主要聚集在第2、3象限，非傳統(tǒng)工藝主要聚集在第1、4象限。由表2可知，PLS-DA模型的測(cè)試集和驗(yàn)證集的擬合系數(shù)（R2Y）分別為0.782和0.801，交叉驗(yàn)證均方根誤差（root mean square error，RMSE）分別為0.237和0.242，模型沒(méi)有過(guò)度擬合；預(yù)測(cè)系數(shù)（Q2）為0.771和0.716，Q2＞0.5，模型的分類(lèi)預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)，PLS-DA模型對(duì)工藝的分類(lèi)識(shí)別判斷準(zhǔn)確率為100%，這些參數(shù)指標(biāo)說(shuō)明紫外光譜技術(shù)結(jié)合PLS-DA模型能快速準(zhǔn)確判斷醬香型白酒傳統(tǒng)工藝。

表2 偏最小二乘判別分析模型對(duì)傳統(tǒng)工藝與非傳統(tǒng)工藝的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率Table 2 Prediction accuracy of partial least squares discriminant analysis model for traditional and non-traditional processes

3 結(jié)論

本研究基于紫外光譜分析法的簡(jiǎn)捷、低成本、快速有效、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)不同工藝醬香型白酒酒體和串蒸的調(diào)香白酒進(jìn)行了紫外光譜檢測(cè)，構(gòu)建了醬香型白酒傳統(tǒng)工藝七個(gè)輪次基酒的紫外光譜曲線(xiàn)變化特征圖，對(duì)比分析了傳統(tǒng)工藝、碎沙工藝及調(diào)香白酒的紫外光譜特征圖譜，在200～320 nm的紫外吸光度區(qū)間建立了傳統(tǒng)工藝與非傳統(tǒng)工藝的PLS-DA預(yù)測(cè)模型。紫外光譜結(jié)合PLS-DA模型驗(yàn)證結(jié)果表明，該模型在傳統(tǒng)工藝和非傳統(tǒng)工藝酒體的識(shí)別分類(lèi)上準(zhǔn)確率達(dá)到100%，證明了光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量法可建立快速評(píng)價(jià)體系。本研究為醬香型白酒傳統(tǒng)工藝輪次基酒的質(zhì)量控制和釀造工藝的快速鑒別提供參考依據(jù)，同時(shí)為感官鑒評(píng)法鑒別不同工藝醬香酒體提供有效的輔助和參考。