呂孟敏，白鳳翎，崔方超，檀茜倩，呂欣然*，勵建榮，2，郭曉華

（1.渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧省高等學(xué)校生鮮食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，遼寧 錦州 121013；2.大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034；3.山東美佳集團有限公司，山東 日照 276800）

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）又稱為2-羥基-3-苯丙酸，含有一個手性碳原子，可以形成兩種對映體，即D-PLA和L-PLA，是一種具有廣譜抗菌活性的化合物[1-4]。多種微生物如乳酸桿菌（Lactobacillus）、芽孢桿菌（Bacillus）、魏斯氏菌（Weissella）和白地霉（Geotrichum candidum）等都具有合成苯乳酸的能力[5-8]。其中，乳酸菌是公認(rèn)的食品級安全（generally recognized as safe，GRAS）微生物，其可利用苯丙酮酸或苯丙氨酸為底物代謝產(chǎn)生苯乳酸，已成為微生物生產(chǎn)苯乳酸的優(yōu)勢菌種，其合成的苯乳酸也被視為食品級安全的天然防腐劑[9-10]。

LAVERMICOCCA P等[11]首次從酸面團中篩選獲得一株產(chǎn)苯乳酸的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）21B，苯乳酸產(chǎn)量為56 mg/L。隨后研究者們從多種環(huán)境來源的乳酸菌中篩選產(chǎn)苯乳酸菌株，STR?M K等[12]從草貯飼料中分離出一株高產(chǎn)苯乳酸的植物乳桿菌MiLAB393，苯乳酸產(chǎn)量為94 mg/L；劉長建等[13]從豬的消化系統(tǒng)中篩選得到24株能夠產(chǎn)苯乳酸的乳酸菌，其中分離自豬糞便的乳酸菌r16苯乳酸產(chǎn)量較高，達(dá)233.0 mg/L；李興峰等[14]從自然發(fā)酵泡菜中分離篩選出一株苯乳酸產(chǎn)量較高的乳酸菌，產(chǎn)量可達(dá)91 mg/L。但由于乳酸菌分離來源的不同，不同菌株間合成苯乳酸產(chǎn)量差異較大，且苯乳酸產(chǎn)量相對都較低[15]。因此，要實現(xiàn)乳酸菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)苯乳酸，篩選高產(chǎn)苯乳酸的乳酸菌具有重要的研究價值和意義。

魚類腸道內(nèi)微生物種類豐富，乳酸菌是其腸道內(nèi)天然棲息的一種益生菌，但由于其生存環(huán)境獨特，其存在大量功能性菌株未被挖掘。因此，本研究通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定苯乳酸含量，從多種魚腸道來源的乳酸菌中篩選高產(chǎn)苯乳酸的菌株，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗及分子生物學(xué)技術(shù)對其進行菌種鑒定，并通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗對其產(chǎn)苯乳酸發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期為進一步實現(xiàn)乳酸菌工業(yè)化生產(chǎn)苯乳酸生物防腐劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株50株乳酸菌：分離自草魚（CY）、刀魚（DY）、鏡鯉（LJ）、牙鲆（YP）和鱸魚（LY）等腸道，均保藏在本實驗室。

1.1.2 試劑

MRS液體培養(yǎng)基（pH5.0）、MRS固體培養(yǎng)基：上海吉至生化科技有限公司；苯丙酮酸、三氟乙酸（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；乳酸菌生化鑒定管：上海澤葉生物科技有限公司；甲醇（色譜級）：上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）：上海源葉生物科技有限公司；細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）快速抽提試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增引物、TaqPCR Master、mixDNA marker-D：上海生工生物工程有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-150B高智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱：山東霍爾德電子科技有限公司；KS50R臺式高速冷凍離心機：鹽城市凱特實驗儀器有限公司；DL-CJ-2N超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造；HT8300/8500全自動凝膠成像分析系統(tǒng)、HT-ECP3000高壓電泳儀電源：北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限公司；PHB-4 pH計：廣州瑞彬科技有限公司；Nikon尼康c1生物顯微鏡：北京長恒榮創(chuàng)科技有限公司；LC-2030高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 高產(chǎn)苯乳酸乳酸菌的篩選

將乳酸菌以2%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，以2%（V/V）的接種量接種到含5 g/L苯丙酮酸的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h[16]。發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm的濾膜過濾，得到乳酸菌的無細(xì)胞上清液。參照侯楠楠等[17]高效液相色譜法檢測苯乳酸的產(chǎn)量，篩選出苯乳酸產(chǎn)量高的乳酸菌菌株。

1.3.2 高產(chǎn)苯乳酸乳酸菌菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：采用四區(qū)劃線法對高產(chǎn)苯乳酸的乳酸菌菌株進行培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并進行革蘭氏染色，采用顯微鏡進行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察[18]。

生理生化鑒定：將高產(chǎn)苯乳酸的乳酸菌用接種針接種到生理生化鑒定管中，30 ℃培養(yǎng)24～48 h后觀察并記錄結(jié)果[19-20]。

16S rDNA序列分析：采用DNA快速抽提試劑盒提取乳酸菌DNA，以其為模板，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3'）對菌株的16S rDNA基因序列進行PCR擴增，PCR擴增體系及條件參照崔天琦等[21]的方法。將擴增后的產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將擴增成功的產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司進行測序，將測序得到的16S rDNA基因序列提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中，與已知模式菌株的16S rDNA基因序列進行基本局部序列比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，尋找同源性較高的菌株，并利用MEGA5.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 高產(chǎn)苯乳酸乳酸菌菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）單因素試驗

通過控制單一變量法對乳酸菌菌株產(chǎn)苯乳酸發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

接種量的影響：將乳酸菌菌株分別以1%、2%、3%、4%、5%、6%和7%（V/V）的接種量接種到含5 g/L苯丙酮酸的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，采用HPLC法檢測菌株培養(yǎng)液中苯乳酸產(chǎn)量，以確定適宜接種量。

發(fā)酵時間的影響：將乳酸菌菌株以2%（V/V）的接種量接種到含5 g/L苯丙酮酸的MRS液體培養(yǎng)基中，分別在37 ℃條件下培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、60 h、72 h后，采用HPLC法檢測菌株培養(yǎng)液中苯乳酸產(chǎn)量，以確定適宜發(fā)酵時間。

初始pH值的影響：將乳酸菌菌株以2%（V/V）的接種量接種到含5 g/L苯丙酮酸、初始pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，采用HPLC法檢測菌株培養(yǎng)液中苯乳酸產(chǎn)量，以確定適宜初始pH值。

發(fā)酵溫度的影響：將乳酸菌菌株以2%（V/V）的接種量接種到含5 g/L苯丙酮酸的MRS液體培養(yǎng)基中，分別于25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃條件下培養(yǎng)24 h，采用HPLC法檢測菌株培養(yǎng)液中苯乳酸產(chǎn)量，以確定適宜發(fā)酵溫度[22-24]。

（2）響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以苯乳酸產(chǎn)量為響應(yīng)值（Y），選擇接種量（A）、發(fā)酵時間（B）、初始pH值（C）和發(fā)酵溫度（D）為自變量，采用Design Expert 13設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面試驗優(yōu)化乳酸菌產(chǎn)苯乳酸的發(fā)酵條件。響應(yīng)面試驗因素及水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment for fermentation process conditions optimization

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

運用Design Expert 13軟件對回歸模型進行分析。試驗均平行測定3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并采用IBM SPSS 23.0軟件以及OriginPro 9.5軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)苯乳酸乳酸菌的篩選

50株乳酸菌在含5 g/L苯丙酮酸MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)只有20株乳酸菌能正常生長，通過HPLC測定20株乳酸菌菌株合成苯乳酸的能力，結(jié)果見表2。

表2 20株乳酸菌菌株苯乳酸含量的測定結(jié)果Table 2 Determination results of phenyllactic acid contents of 20 lactic acid bacteria strains

由表2可知，9株乳酸菌菌株的苯乳酸含量＞1.00mg/mL，其中乳酸菌菌株DY2的苯乳酸產(chǎn)量顯著高于其他乳酸菌菌株（P＜0.05），為2.45 mg/mL。侯楠楠等[25]篩選得到1株產(chǎn)苯乳酸含量較高的乳酸菌BLCC2-0069，該菌株以5 g/L苯丙酮酸為底物發(fā)酵24 h時，苯乳酸的產(chǎn)量達(dá)到2.55 mg/mL，與本研究菌株DY2的苯乳酸產(chǎn)量相近。因此，確定菌株DY2為高產(chǎn)苯乳酸菌株。

2.2 高產(chǎn)苯乳酸乳酸菌DY2的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

菌株DY2的菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1可知，菌株DY2的菌落呈圓形或橢圓形、光滑、乳白色、不透明、周圍有溶鈣圈，革蘭氏染色結(jié)果呈陽性，菌體形態(tài)為桿狀。

圖1 乳酸菌菌株DY2的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of lactic acid bacteria strain DY2

2.2.2 生理生化試驗

菌株DY2的生理生化試驗結(jié)果見表3。由表3可知，菌株DY2可發(fā)酵纖維二糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、鼠李糖、甘露醇、蜜二糖肉湯、果糖、松三糖肉湯、半乳糖、七葉甘，不能發(fā)酵乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖酸鹽、棉籽糖、山梨醇、木糖，結(jié)合形態(tài)觀察，根據(jù)《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法》[20]，初步判定菌株DY2為魏斯氏菌屬（Weissellasp.）。

從廣州出發(fā)飛 行了16個小時，再坐上2小時的大巴，穿越一片片平坦開闊的葡萄園、橄欖園，路過一棟棟白色或淺黃色的石屋，終于抵達(dá)普利亞產(chǎn)區(qū)的中心城市：曼杜里亞。此時接近正午，陽光正好，清勁的海風(fēng)撲面而來，一下子驅(qū)散了長途旅行的不適?？諝庵袕浡蠙煜恪⒛嗤料?，暖暖的，非常愜意。放眼望去，都是狹窄的石頭街道、古老的石頭房子和教堂，街上行人寥寥。

表3 乳酸菌菌株DY2的生理生化試驗結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical tests results of lactic acid bacteria strain DY2

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

基于16S rDNA基因序列，菌株DY2的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。由圖2可知，菌株DY2與融合魏斯氏菌（Weissella confuse）5952聚于一支，相似度達(dá)到99%，親緣關(guān)系最近，因此，鑒定菌株DY2為融合魏斯氏菌（Weissella confuse）。

圖2 基于16S rDNA基因序列乳酸菌菌株DY2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria strain DY2 based on 16S rDNA gene sequence

2.3 乳酸菌菌株DY2產(chǎn)苯乳酸發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗

接種量、發(fā)酵時間、初始pH值和發(fā)酵溫度對融合魏斯氏菌DY2產(chǎn)苯乳酸的影響見圖3。

圖3 接種量（a）、發(fā)酵時間（b）、初始pH值（c）及發(fā)酵溫度（d）對融合魏斯氏菌DY2苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of inoculum (a), fermentation time (b), initial pH (c) and fermentation temperature (d) on phenyllactic acid production by Weissella confuse DY2

由圖3a可知，接種量對乳酸菌DY2合成苯乳酸的能力有較大的影響，當(dāng)接種量在1%～3%的范圍內(nèi)，隨著接種量的增加，苯乳酸產(chǎn)量逐漸增加，說明在一定接種量范圍內(nèi)，接種量越大，菌株代謝越快，從而使苯乳酸產(chǎn)量增加[26]；當(dāng)接種量為3%時，苯乳酸產(chǎn)量最高，為2.54 mg/mL；當(dāng)接種量＞3%之后，隨著接種量的增加苯乳酸產(chǎn)量逐漸減少，分析原因可能是較高的接種量導(dǎo)致菌株繁殖速度過快，造成營養(yǎng)物質(zhì)不足，從而導(dǎo)致乳酸菌合成苯乳酸的能力降低，這與黃國昌等[26]研究結(jié)果相似。因此，確定最優(yōu)接種量為3%。

由圖3b可知，發(fā)酵時間對乳酸菌DY2合成苯乳酸的能力也有很大的影響，當(dāng)發(fā)酵時間在12～72 h的范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵時間的延長，苯乳酸產(chǎn)量呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)發(fā)酵48 h時，苯乳酸產(chǎn)量最高，為2.37 mg/mL。發(fā)酵時間＞48 h后，苯乳酸的產(chǎn)量下降，分析原因可能是隨著發(fā)酵時間的延長，營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，營養(yǎng)物質(zhì)減少到一定程度后導(dǎo)致苯乳酸的產(chǎn)量開始有所減少[27]。因此，確定最佳發(fā)酵時間為48 h。

由圖3c可知，隨著初始pH值的升高，苯乳酸產(chǎn)量呈先升高后下降的趨勢，當(dāng)初始pH值為6.0時，苯乳酸產(chǎn)量達(dá)到最高，為2.65 mg/mL。初始pH值偏高或偏低都會影響苯乳酸含量的下降，這可能是因為pH值偏高或偏低都會影響菌株細(xì)胞內(nèi)酶的反應(yīng)環(huán)境以及菌株的生長[28-29]，從而影響乳酸菌合成苯乳酸的產(chǎn)量。因此，確定最佳初始pH值為6.0。

2.3.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取接種量（A）、發(fā)酵時間（B）、初始pH值（C）、發(fā)酵溫度（D）4個因素作為影響因子，以苯乳酸產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，采用Design Expert 13設(shè)計4因素3水平的Box-Behnken試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表4，回歸模型方差分析見表5。

表4 乳酸菌菌株DY2產(chǎn)苯乳酸發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization of phenyllactic acid production by lactic acid bacteria strain DY2

表5 回歸模型的方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

使用Design Expert 13軟件對不同培養(yǎng)條件下苯乳酸產(chǎn)量進行多元回歸擬合計算，得到接種量、發(fā)酵時間、初始pH值、發(fā)酵溫度對苯乳酸含量的二次多項回歸模型方程：Y=2.91+0.139 2A+0.059 2B+0.008 3C-0.013 3D-0.120 0AB-0.032 5AC-0.010 0AD-0.010 0BC+0.002 5BD+0.002 5CD-0.364 2A2-0.134 2B2-0.080 4C2-0.375 4D2。

由表4可知，回歸模型P值為0.000 1＜0.05，極顯著，失擬項P值為0.172 4＞0.05，不顯著。決定系數(shù)R2=93.64%，說明該模型的相關(guān)性較好，校正決定系數(shù)R2Adj=87.28%，說明該模型的預(yù)測值與實測值擬合效果較好，能解釋本試驗87.28%響應(yīng)值的變化情況。方差結(jié)果分析得出，一次項A及二次項A2、B2、D2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項B、交互項AB及二次項C2對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項則對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

響應(yīng)面圖和等高線圖可以用來直觀地表示各變量之間的交互作用及響應(yīng)值在極點時各自變量的最佳水平，響應(yīng)曲面坡度越陡，等高線越趨于橢圓形，說明對響應(yīng)值影響越大[26]。接種量和發(fā)酵時間間交互作用對苯乳酸產(chǎn)量影響的響應(yīng)面和等高線見圖4。

圖4 接種量和發(fā)酵時間交互作用對苯乳酸產(chǎn)量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between inoculum and fermentation time on phenyllactic acid production

由圖4可知，接種量（A）與發(fā)酵時間（B）間交互作用的響應(yīng)面圖曲面坡度明顯，等高線為橢圓形，表明二者間交互作用對苯乳酸產(chǎn)量影響顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

通過回歸方程得到回歸模型預(yù)測的最佳發(fā)酵條件為接種量3.168%，發(fā)酵時間49.738 h，初始pH值6.005，發(fā)酵溫度33.942 ℃，此時苯乳酸產(chǎn)量的最大預(yù)測值為2.926 mg/mL。為便于實際操作，將最佳條件修訂為接種量3%，發(fā)酵時間50 h，初始pH值6.0，發(fā)酵溫度34 ℃。為驗證模型的可靠性和最大預(yù)測值的準(zhǔn)確性，用上述最佳發(fā)酵條件進行三次平行驗證試驗，苯乳酸產(chǎn)量實際值為2.99 mg/mL，與預(yù)測值接近，說明該模型能準(zhǔn)確反映各因素的變化與苯乳酸產(chǎn)量之間的關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究從魚腸道來源的50株乳酸菌中篩選獲得1株高產(chǎn)苯乳酸菌株DY2，苯乳酸產(chǎn)量為2.45 mg/mL；通過形態(tài)觀察、生理生化試驗及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定其為融合魏斯氏菌（Weissella confuse）。以苯乳酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，通過單因素試驗和Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化確定菌株DY2產(chǎn)苯乳酸的最適發(fā)酵條件為接種量3%、發(fā)酵時間50 h、初始pH值6.0、發(fā)酵溫度34 ℃。在此條件下，苯乳酸產(chǎn)量為2.99 mg/mL，是優(yōu)化前的1.22倍。