柯 悅，鄧子文，姜在明，向凡舒，侯強川，郭 壯*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽441053；2.襄陽市釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 襄陽441053；3.棗陽市靈鹿酒業(yè)有限公司，湖北 襄陽441203）

我國黃酒釀造歷史悠久，按照產(chǎn)區(qū)被劃分為浙江紹興黃酒[1]、湖北房縣黃酒[2]和廣東客家黃酒[3]等眾多具有地域特色的黃酒品類[4]。制曲釀酒是我國酒之特色，自古有“曲乃酒之骨”之說[5]，曲中蘊含的復(fù)雜微生物群系是推動黃酒釀造的主要動力，對黃酒的風(fēng)味形成起到了關(guān)鍵作用[6]，因而不同的曲塑造出了不同的黃酒風(fēng)格特征。除了地域環(huán)境的差別，不同產(chǎn)區(qū)在釀造黃酒時所采用的曲亦有所差別。目前許多研究人員都開始關(guān)注黃酒釀造用曲中的微生物群系。在釀造紹興黃酒的麥曲中，席啦等[7]研究發(fā)現(xiàn)，曲霉屬（Aspergillus）和酵母屬（Saccharomyces）為主要的真菌；LIU S P等[8]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬（Bacillus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）為主要的細菌；而HUANG Z R等[9]研究發(fā)現(xiàn)，紫色紅曲霉（Monascus purpureus）和人參土魏茨曼氏菌（Weizmannia ginsengihumi）分別為紅曲中豐度最高的真菌和細菌，少根根霉（Rhizopus arrhizus）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）分別為小曲中豐度最高的真菌和細菌。不同曲中的微生物類群之間存在較大差異，而這些差異可能正是形成黃酒不同風(fēng)格特征的主要原因之一。

湖北棗陽市鹿頭鎮(zhèn)釀制地封黃酒的主要原料是當(dāng)?shù)氐膬?yōu)質(zhì)糯米、小麥、富含礦物質(zhì)的井水及其他輔料，采用傳統(tǒng)的技藝方法，經(jīng)過自制麥曲和高溫大曲以及黃酒釀制三大技藝和十多道主要釀制流程，通過長時間的糖化、發(fā)酵釀制，純天然無污染。與采用小曲發(fā)酵的湖北房縣黃酒不同，棗陽鹿頭鎮(zhèn)生產(chǎn)的黃酒采用高溫大曲和小曲共同發(fā)酵，二者的風(fēng)味特征極為不同。房縣黃酒色澤清亮，米香濃郁和酒味甘醇，而鹿頭黃酒色澤澄黃、芳香馥郁和綿柔甜美，回味中略帶苦澀。與房縣黃酒相比，鹿頭黃酒較為獨特的風(fēng)味特征或許與其使用的高溫大曲有關(guān)。在開始發(fā)酵前大曲塊要按照橫三豎三交錯側(cè)立的方式在曲房排列至行六層五，這種堆積方式使得發(fā)酵時曲堆中心溫度要略高于外圍溫度，且經(jīng)過發(fā)酵后位于中心的大曲塊通常呈黑色，而外圍的大曲塊通常呈黃色。目前已有不少研究證明了不同顏色高溫大曲的理化性質(zhì)與微生物類群存在顯著差異[10-11]，解析鹿頭黃酒高溫大曲的真菌類群對理解鹿頭黃酒風(fēng)味形成機理具有積極意義。

本研究以鹿頭黃酒釀造用黑色和黃色高溫大曲為研究對象，對其常規(guī)理化指標進行檢測，進一步采用MiSeq高通量測序技術(shù)對其真菌類群進行解析，并揭示高溫大曲真菌類群與其理化指標之間的相關(guān)性，以期為鹿頭黃酒釀造用高溫大曲制曲工藝的改良提供一定的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

高溫大曲樣品：湖北省襄陽市棗陽市某家黃酒生產(chǎn)企業(yè)。其中黑色高溫大曲（簡稱黑曲，編號為B1～B10）和黃色高溫大曲（簡稱黃曲，編號為Y1～Y10）樣品各10份，兩種顏色的大曲生產(chǎn)于同一批次，采用的原料與制作工藝完全一致。該企業(yè)在生產(chǎn)高溫大曲時對原料進行了改良，其原料不僅包括小麥等糧食作物，還包括辣蓼草（Polygonum hydropiper）、益母草（Leonurus japonicus）和青蒿（Artemisia apiacea）等中藥材。每塊大曲在發(fā)酵前均使用了荷葉進行包裹，以防發(fā)酵過程中大曲塊發(fā)生粘連。采集的樣品均裝入無菌采樣袋中在常溫下運送回實驗室，并將樣品打碎至粉末狀后分別裝入自封袋中置于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

DNeasy mericon Food Kit 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；正/反向引物ITS3F/ITS4R（ITS3F：5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'；ITS4R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）：上海桑尼生物科技有限公司；Illumina MiSeq測序試劑盒v3：美國Illumina公司；氫氧化鈉、鹽酸、次甲基藍、葡萄糖、碘、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、甲醛、硫酸銨、硫酸、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠和乙醇（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑：寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SH-10A水分測定儀：上海力辰儀器科技有限公司；KBF1700高溫箱式爐：南京南大儀器廠；PHS-3C數(shù)顯臺式酸度計：上海越平科學(xué)儀器有限公司；K1100全自動定氮儀：濟南海能儀器股份有限公司；Vetiri PCR梯度基因擴增儀：美國AB公司；MiSeq PE300高通量測序平臺：美國Illumina公司；R930機架式服務(wù)器：美國DELL公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 高溫大曲的理化指標測定

高溫大曲的水分含量、灰分、酸度、淀粉和氨基酸態(tài)氮含量：參照輕工行業(yè)標準QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》中的方法進行測定[12]，蛋白質(zhì)含量：參照國家標準GB/T 33862—2017《全（半）自動凱氏定氮儀》中的方法進行測定[13]。

1.3.2 宏基因組DNA提取、PCR擴增和MiSeq高通量測序

參照DNeasy mericon Food Kit DNA試劑盒使用說明對高溫大曲中微生物宏基因組DNA進行提取，參照陳怡等[14]的方法使用引物ITS3F/ITS4R對真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）2進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成高通量測序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

參照郭壯等[15]的方法對測序返回的序列進行質(zhì)控，基于QIIME v1.95平臺采用UCLUST兩步法對有效序列分別按照100%和97%相似度劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[16]，并進行嵌合體檢查[17]?；赨NITE v7.2數(shù)據(jù)庫對真菌類群進行物種注釋[18]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用GrahPad Prism v9軟件繪制小提琴圖，使用R v4.1.0軟件繪制物種累積箱型圖和氣泡圖；使用SAS v8軟件中的Spearman分析計算優(yōu)勢真菌屬與理化指標間的相關(guān)性系數(shù)和顯著性，并使用Cytoscape v3.7.2軟件繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖；使用Past3軟件中的Mann-Whitney檢驗進行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿頭黃酒釀造用黑色和黃色高溫大曲理化指標分析

對不同類型鹿頭黃酒釀造用高溫大曲（黑曲和黃曲）的水分含量、灰分、酸度、淀粉、蛋白質(zhì)和氨基酸態(tài)氮含量等理化指標進行測定，結(jié)果見圖1。

圖1 鹿頭黃酒釀造用高溫大曲理化指標的比較分析Fig.1 Comparative analysis of physicochemical indexes of hightemperature Daqu for Lutou Huangjiu brewing

由圖1可知，鹿頭黃酒釀造用高溫大曲的水分含量為6.86%～12.28%，灰分為4.86～5.58 g/100 g，酸度為1.9～3.6 mmol/10 g，淀粉含量為49.45%～57.68%，蛋白質(zhì)含量為20.16%～28.28%，氨基酸態(tài)氮含量為4.04～6.08 g/kg。通常水分含量降低到12.5%是曲培進入貯藏期的一個節(jié)點，這說明本研究所用高溫大曲均到達成熟階段[19]。經(jīng)Mann-Whitnay檢驗發(fā)現(xiàn)，與黃曲相比，黑曲中蛋白質(zhì)含量顯著偏高（P＜0.05），而酸度和氨基酸態(tài)氮含量顯著偏低（P＜0.05），黑曲蛋白質(zhì)含量、酸度和氨基酸態(tài)氮含量分別為23.8%、2.5 mmol/10 g和5.1 g/kg，而在黃曲中則分別為21.9%、3.0 mmol/10 g和5.6 g/kg。將高溫大曲應(yīng)用在醬香型白酒釀造中，王穎等[20-21]分別對不同產(chǎn)區(qū)和不同曲層中高溫大曲理化成分進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同顏色和不同曲層的大曲樣品理化指標存在一定的差異性。大曲中的酸度主要來源于微生物代謝產(chǎn)生的有機酸和氨基酸，以及淀粉、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)降解后進入三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的各種酸類物質(zhì)[19]，這較好的解釋了蛋白質(zhì)與酸度和氨基酸態(tài)氮在樣品中的含量高低呈現(xiàn)出相反趨勢的原因。

2.2 鹿頭黃酒釀造用黑色和黃色高溫大曲物種累積箱型圖分析

經(jīng)高通量測序，20個樣品共產(chǎn)生1 144 701條有效序列，平均每個樣品包含57 235條，所有序列經(jīng)97%相似度劃分聚類共得到4 863個操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），所有樣品中的真菌隸屬于5個門、18個綱、32個目、46個科和76個屬。為確定采集樣本量是否滿足實驗要求，繪制20份高溫大曲的真菌物種累計箱型圖見圖2。

圖2 鹿頭黃酒釀造用高溫大曲真菌物種累積箱型圖Fig.2 Cumulative boxplots of fungal species of high-temperature Daqu for Lutou Huangjiu brewing

由圖2可知，隨著樣品數(shù)量的增加，物種累積曲線不斷上升，且上升幅度逐漸減小，最終趨于平緩，表明本研究樣品已幾乎覆蓋高溫大曲中的所有真菌物種，繼續(xù)增加樣品數(shù)量并不會出現(xiàn)物種量顯著增加的現(xiàn)象。因此，樣品數(shù)量已達到后續(xù)分析的需求。

2.3 基于門和屬水平鹿頭黃酒釀造用黑色和黃色高溫大曲真菌類群解析

將相對豐度＞1.0%的門和屬定義為優(yōu)勢門和優(yōu)勢屬，基于門和屬水平鹿頭黃酒釀造用高溫大曲中的真菌菌群結(jié)構(gòu)見圖3。

圖3 基于門（a）和屬（b）水平鹿頭黃酒釀造用高溫大曲真菌菌群結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of fungal community in high-temperature Daqu for Lutou Huangjiu brewing based on phylum(a)and genus(b)level

由圖3A可知，鹿頭黃酒釀造用高溫大曲樣品共含有3個優(yōu)勢門，分別為子囊菌門（Ascomycota）（86.24%）、毛霉門（Mucoromycota）（11.83%）和結(jié)合菌門（Zygomycota）（1.77%）。除樣品B10以外，其他樣品均以Ascomycota相對豐度為最高。經(jīng)Mann-Whitnay檢驗發(fā)現(xiàn)，黑曲和黃曲中優(yōu)勢真菌門的相對豐度差異并不顯著（P＞0.05）。

由圖3B可知，鹿頭黃酒釀造用高溫大曲中共有9個優(yōu)勢屬，分別為紅曲霉屬（Monascus）（31.66%）、腹膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）（18.54%）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）（12.39%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（11.12%）、根毛霉屬（Rhizomucor）（8.35%）、黃梗霉屬（Lichtheimia）（5.11%）、曲霉屬（Aspergillus）（3.72%）、絲衣霉屬（Byssochlamys）（3.59%）和旱霉屬（Xeromyces）（3.05%）。經(jīng)Mann-Whitnay檢驗發(fā)現(xiàn)，與黃曲相比，黑曲中Monascus的相對豐度顯著偏低（P＜0.05），而Thermoascus的相對豐度顯著偏高（P＜0.05），其中Monascus和Thermoascus在黑曲中的相對豐度分別為4.97%和22.21%，在黃曲中分別為58.36%和4.97%。由此可見，鹿頭黃酒釀造用高溫大曲中蘊含的真菌類群主要為霉菌，累計相對豐度占總真菌類群的66.60%。黑曲是由于大曲在發(fā)酵前期升溫較快所形成的，Thermoascus不僅可在45 ℃以上的環(huán)境中存活，還可產(chǎn)生具有高熱穩(wěn)定性的酶[22]，因而在高熱環(huán)境中能穩(wěn)定生長繁殖，這或許是黑曲中Thermoascus豐度較高的原因。在對四川和貴州地區(qū)白酒釀造用高溫大曲微生物類群進行解析時，DENG L等[23-24]研究發(fā)現(xiàn)，黑曲和黃曲的微生物類群存在一定的差異，且兩類酒曲中均蘊含了豐富的Thermoascus，而未發(fā)現(xiàn)有Monascus，與本研究結(jié)果有較大不同。值得注意的是，Monascus屬于不耐高溫的真菌，通常在紅曲和低溫大曲中有較多富集[25-26]，而在高溫大曲中豐度較少。因而導(dǎo)致黃曲中Monascus相對豐度過高的原因或許與制曲溫度偏低亦或是所經(jīng)歷的高溫發(fā)酵時間較短有關(guān)。

2.4 基于OTU水平鹿頭黃酒釀造用高溫大曲核心真菌類群解析

將在20個樣品中均存在的OTU定義為核心OTU，因這些真菌類群在所有酒曲中均存在，因而其在鹿頭黃酒釀造中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如它們能分泌蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等多種酶，并合成風(fēng)味物質(zhì)及其前體物質(zhì)[27]。鹿頭黃酒釀造用高溫大曲核心OTU平均相對豐度統(tǒng)計結(jié)果見表1。

表1 鹿頭黃酒釀造用高溫大曲核心操作分類單元平均相對豐度統(tǒng)計Table 1 Statistics of the average relative abundance of core operational taxonomic units of high-temperature Daqu for Lutou Huangjiu brewing

由表1可知，有3個核心OTU在20個高溫大曲中均存在，均被鑒定為覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis），且黑曲和黃曲中核心OTU的平均相對含量間不存在顯著差異（P＞0.05）。由此可見，Saccharomycopsis對鹿頭黃酒品質(zhì)的形成可能具有積極的意義。通過純培養(yǎng)技術(shù)，研究人員在小曲和大曲等多種類型的酒曲中發(fā)現(xiàn)了扣囊覆膜酵母菌（Saccharomycopsis fibuligera）的存在[28-29]。S.fibuligera通常被認為是發(fā)酵食品中降解淀粉的主要酵母菌菌種[30]，因而在釀酒過程中它可能起到了將大分子的淀粉降解為低分子糖的作用，促使低分子糖被水解成葡萄糖，最終對酒精發(fā)酵產(chǎn)生了積極影響[31]。值得一提的是，本研究并未發(fā)現(xiàn)在所有黑曲中均存在但在黃曲中均不存在，或在所有黃曲中均存在但在黑曲中均不存在的OTU。

2.5 鹿頭黃酒釀造用高溫大曲真菌類群與理化指標之間的相關(guān)性分析

進一步對鹿頭黃酒釀造中高溫大曲蘊含的優(yōu)勢真菌類群與各理化指標間的相關(guān)性進行分析，結(jié)果見圖4。

圖4 鹿頭黃酒釀造用高溫大曲優(yōu)勢真菌屬與理化指標之間的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between dominant fungal genera and physicochemical indexes of high-temperature Daqu for Lutou Huangjiu brewing

由圖4可知，Monascus與蛋白質(zhì)含量之間呈顯著負相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）（相關(guān)系數(shù)R=-0.492）；Saccharomycopsis與淀粉呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）（相關(guān)系數(shù)R=0.484），與酸度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）（相關(guān)系數(shù)R=0.633）；Thermomyces與淀粉含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）（相關(guān)系數(shù)R=0.477）；Rhizomucor與酸度呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）（相關(guān)系數(shù)R=-0.539）；Bssochlamys與淀粉呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）（R=-0.579）。由此可見，高溫大曲中的Monascus和Rhizomucor可能分別具有較強的降解蛋白質(zhì)和淀粉能力，而Thermomyces和Rhizomucor降解淀粉的能力較弱。

3 結(jié)論

本研究對鹿頭黃酒釀造用黑色和黃色高溫大曲理化指標進行測定和真菌類群進行解析，并對兩者的關(guān)聯(lián)性進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩類高溫大曲理化指標和真菌類群均存在一定的差異，黑色高溫大曲蛋白質(zhì)含量偏高而酸度和氨基酸態(tài)氮含量偏低，Monascus、Saccharomycopsis、Thermomyces、Thermoascus、Rhizomucor、Lichtheimia、Aspergillus、Byssochlamys和Xeromyces為兩類高溫大曲中的主要真菌類群，Monascus在黃色大曲中含量偏高而Thermoascus在黑色大曲中含量偏高，且Monascus與高溫大曲蛋白質(zhì)含量呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），而Thermomyces與高溫大曲淀粉含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。