程馳新笑，易宗偉，王玉榮，崔夢(mèng)君，趙慧君，郭 壯*

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.湖北文理學(xué)院 乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽(yáng)市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 襄陽(yáng) 441053）

“鲊”是指將面粉或米粉混以瓜果、蔬菜、魚肉及食鹽腌制而成的發(fā)酵食品，發(fā)源至今已有2 000多年歷史[1]。作為“鲊”的一種，鲊廣椒是以二荊條辣椒（Capsicum annuumL.）和玉米粉為原料，輔以食鹽、土豆絲或芋頭絲等輔料，置于陶壇中密封發(fā)酵而成[2]。乳酸菌是鲊廣椒發(fā)酵過(guò)程中的重要菌群，賦予了鲊廣椒酸香可口的特點(diǎn)[3]，ZHANG Z D等[4]相繼從鲊廣椒中分離出了4個(gè)乳酸菌新種，分別為鲊廣椒伴生乳桿菌（Companilactobacillus zhachilii）HBUAS52074T、恩施促生乳桿菌（Lactobacillus enshiensis）HBUAS57009T[5]、土家促生乳桿菌（Levilactobacillus tujiae）HBUAS51241T[6]和安琪嗜戊糖乳桿菌[6]（Secundilactobacillus angelii）HBUAS 51383T，表明鲊廣椒中蘊(yùn)含了豐富而獨(dú)特的乳酸菌資源。

重慶市東部區(qū)地處武陵山區(qū)，毗鄰鄂湘黔三省，屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候[7]，生態(tài)多樣性較高，加之當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族眾多且居民具有食用鲊廣椒的習(xí)俗，因而該地區(qū)鲊廣椒中可能蘊(yùn)含了豐富的乳酸菌資源。近年來(lái)，Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)突破了傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)方法的限制[8]，在鲊廣椒微生物多樣性解析方面亦有了一定的應(yīng)用，如GUO Z等[9]利用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)伴生乳桿菌屬（Companilactobacillus）、乳植物桿菌屬（Lactiplantibacillus）和棒狀桿菌屬（Corynebacterium）是湖南懷化市和貴州銅仁市兩個(gè)地區(qū)鲊廣椒中的核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，且不同地區(qū)的鲊廣椒其細(xì)菌多樣性存在一定的差異。重慶東部地區(qū)亦有食用鲊廣椒的習(xí)俗，但民間認(rèn)為鲊廣椒起源于重慶市中東部地區(qū)，因而開(kāi)展重慶東部地區(qū)鲊廣椒源乳酸菌菌株的挖掘工作，同時(shí)對(duì)其鲊廣椒細(xì)菌菌群多樣性進(jìn)行解析，對(duì)全面剖析鲊廣椒這一地方特色發(fā)酵食品的微生物類群具有積極的意義。

本研究從重慶東部的石柱縣、云陽(yáng)縣、彭水縣、萬(wàn)州區(qū)和黔江區(qū)共采集鲊廣椒樣品51份，使用傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)其蘊(yùn)含的乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定，使用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其細(xì)菌菌群多樣性進(jìn)行了解析，以期為鲊廣椒中乳酸菌資源的挖掘提供菌株支持，為鲊廣椒的產(chǎn)業(yè)化推動(dòng)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鲊廣椒：采集自重慶東部5個(gè)地區(qū)的51份樣品，均為農(nóng)戶使用當(dāng)?shù)卦牧献灾贫?，樣品信息概述?jiàn)表1；MRS培養(yǎng)基、碳酸鈣（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；基因組提取試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司；rTaq酶、10×Buffer、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）：北京全式金生物技術(shù)有限公司；高通量測(cè)序配套試劑：美國(guó)Illumina公司。

表1 樣品采樣地及編號(hào)Table 1 Sampling place and code of samples

1.2 儀器與設(shè)備

DG250厭氧工作站：英國(guó)DWS公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ECLIPSE Ci生物顯微鏡：日本Nikon公司；Veriti FAST梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)ABI公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)Protein Simple公司；PE300高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；R920機(jī)架式服務(wù)器：美國(guó)DELL公司。

1.3 方法

1.3.1 鲊廣椒中乳酸菌菌株的分離純化

準(zhǔn)確稱取10 g鲊廣椒，加入裝有90 mL生理鹽水的錐形瓶?jī)?nèi)，37℃振蕩30min，使其充分混勻制成10-1梯度，依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，取10-4、10-5和10-6稀釋液進(jìn)行涂布，將涂布后的培養(yǎng)皿置于厭氧工作站（含80%N2、10%H2和10%CO2），30 ℃培養(yǎng)48 h[10]。挑選具有溶鈣圈的單菌落，進(jìn)行三區(qū)域劃線純化，將革蘭氏染色為陽(yáng)性，過(guò)氧化氫接觸酶為陰性，鏡檢結(jié)果合格的菌株，使用30%甘油保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.3.2 鲊廣椒中乳酸菌菌株的鑒定

采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethyl ammonium bbromide，CTAB）法進(jìn)行分離菌株DNA的提取，將檢測(cè)合格的DNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和連接轉(zhuǎn)化。將瓊脂糖電泳檢測(cè)合格的克隆子送往上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，返回序列拼接后于美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.3.3 鲊廣椒中微生物宏基因組DNA提取及Illumina MiSeq測(cè)序

按照每個(gè)地區(qū)樣品數(shù)不少于2個(gè)不多于6個(gè)的原則，從51個(gè)鲊廣椒樣品中累計(jì)選取24個(gè)樣品進(jìn)行Illumina MiSeq測(cè)序，其中石柱縣、萬(wàn)州區(qū)和云陽(yáng)縣各選取6個(gè)，編號(hào)分別為SZ1～SZ6、WZ1～WZ6和YY1～YY6，彭水縣4個(gè)，編號(hào)為PS1～PS4，黔江區(qū)2個(gè)，編號(hào)為QJ1～QJ2。

準(zhǔn)確稱取2.0 g鲊廣椒樣品，按照基因組提取試劑盒說(shuō)明書內(nèi)容進(jìn)行DNA的提取。參照李潔等[11]的擴(kuò)增體系使用通用引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）對(duì)檢測(cè)合格的樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

在2018年全國(guó)教育工作會(huì)議上，習(xí)近平指出，要把“立德樹(shù)人”融入教育實(shí)施各環(huán)節(jié)，學(xué)科體系、教學(xué)體系、教材體系、管理體系要以此為目標(biāo)來(lái)設(shè)計(jì)，教師教學(xué)、學(xué)生求學(xué)都要圍繞這個(gè)目標(biāo)?！傲⒌聵?shù)人”既是宏觀層面的根本任務(wù)和目標(biāo)，也是微觀層面的操作辦法和實(shí)施路徑，筆者主要討論課堂教學(xué)活動(dòng)層面的“立德樹(shù)人”。立何“德”、樹(shù)何“人”？何以立“德”、何以樹(shù)“人”？是貫穿在各教學(xué)環(huán)節(jié)的主要問(wèn)題，也是教學(xué)預(yù)警指標(biāo)設(shè)計(jì)的主要參考點(diǎn)。

使用QIIME（QuantitativeInsightsIntoMicrobialEcology，v1.9.1）平臺(tái)對(duì)下機(jī)后的序列進(jìn)行質(zhì)量控制[12]，按照97%的相似度進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）矩陣劃分；使用UCHIME去除嵌合體后[13]，選取代表性序列通過(guò)核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目（ribosomal database project，RDP）[14]、GREENGENE[15]和SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)[16]進(jìn)行物種的注釋，進(jìn)而對(duì)其分類學(xué)地位進(jìn)行確定。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

使用MEGA 7.0的和R（v4.1.3）軟件對(duì)乳酸菌分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行構(gòu)建；使用Origin 2018軟件對(duì)平均相對(duì)豐度大于1.0%細(xì)菌門和細(xì)菌屬的堆積圖進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 鲊廣椒樣品乳酸菌的分離、鑒定及統(tǒng)計(jì)

通過(guò)純培養(yǎng)技術(shù)，51個(gè)鲊廣椒樣品共分離純化得到122株乳酸菌，經(jīng)同源性比對(duì)隨機(jī)挑選同一種的各一株菌作為代表系列與模式菌株序列利用MEGA7.0和R軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 基于16S rRNA基因序列的部分乳酸菌分離株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of some lactic acid bacteria isolates based on 16S rRNA gene sequence

由圖1可知，所有乳酸菌歸屬于5個(gè)屬下的22個(gè)種，分別為隸屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的戊糖乳桿菌（L.pentosus）、消化乳桿菌（L.alimentarius）、植物乳稈菌（L.plantarum）、酸魚乳桿菌（L.acidipiscis）、類植物乳桿菌（L.paraplantarum）、蘇氏乳桿菌（L.suantsaii）、副干酪乳桿菌（L.paracasei）、清酒乳桿菌（L.sakei）、彎曲乳桿菌（L.curvatus）、福菜乳桿菌（L.futsaii）、肉糜乳桿菌（L.insicii）、短乳桿菌（L.brevis）、布氏乳桿菌（L.buchneri）和類谷糠乳桿菌（L.parafarraginis）共14個(gè)種，隸屬于魏斯氏菌屬（Weissella）的綠色魏氏菌（W.viridescens）、赫倫魏斯氏菌（W.hellenica）和泰蘭氏魏氏菌（W.thailandensis）共3個(gè)種，隸屬于片球菌屬（Pediococcus）的戊糖片球菌（P.pentosaceus）和乳酸片球菌（P.acidilactici）共2個(gè)種，隸屬于腸球菌屬（Enterococcus）的耐久腸球菌（E.durans）和屎腸球菌（E.faecium）共2個(gè)種，隸屬于明串珠菌屬（Leuconostoc）的腸膜明串珠菌（L.mesenteroides）共1個(gè)種?；诩兣囵B(yǎng)技術(shù)，對(duì)鲊廣椒乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，其多樣性分析見(jiàn)表2。

表2 基于純培養(yǎng)技術(shù)鲊廣椒中乳酸菌多樣性分析Table 2 Diversity analysis of lactic acid bacteria in zha-chili samples by pure culture technology

由表2可知，隸屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）的菌株共分離出102株、10株、4株、3株和3株，分別占總分離株的83.61%、8.20%、3.27%、2.46%和2.46%。在分離到的102株乳酸桿菌菌株中，共分離出戊糖乳桿菌（L.pentosus）、消化乳桿菌（L.alimentarius）和植物乳桿菌（L.plantarum）32株、25株和23株，分別占乳酸桿菌分離株的31.37%、24.51%和22.55%，占乳酸菌總分離株的26.23%、20.49%和18.85%。由此可見(jiàn)，重慶東部地區(qū)鲊廣椒中乳酸菌類群以乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為主，且L.pentosus、L.alimentarius和L.plantarum為其主要乳酸桿菌類群。本研究發(fā)現(xiàn)L.pentosus是重慶東北地區(qū)鲊廣椒中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌之一，而席啦等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)，湖北省宜昌市秭歸縣和荊州市洪湖市等地區(qū)鲊廣椒中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌為L(zhǎng).plantarum，且均未分離出L.pentosus，與本研究存在一定差異。由此可見(jiàn)，不同地區(qū)的鲊廣椒其乳酸菌類群存在較大的差異，因而從不同地區(qū)鲊廣椒中收集和挖掘乳酸菌資源是極為必要的。

2.2 基于MiSeq測(cè)序技術(shù)鲊廣椒細(xì)菌群落組成分析

2.2.1 基于門水平鲊廣椒樣品細(xì)菌群落組成分析

在24個(gè)鲊廣椒樣品中平均相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌門見(jiàn)圖2。

圖2 基于門水平鲊廣椒中細(xì)菌菌群多樣性分析結(jié)果Fig.2 Analysis results of bacterial community diversity in zha-chili samples at phylum level

由圖2可知，重慶東部地區(qū)鲊廣椒中平均相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌門有3個(gè)，分別為厚壁菌門（Firmicutes）（80.36%）、變形菌門（Proteobacteria）（15.88%）和放線菌門（Actinobacteria）（3.38%）。CAI W C等[19]對(duì)湖南省湘西土家族苗族自治州的鲊廣椒細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門亦為厚壁菌門、變形菌門和放線菌門，平均相對(duì)含量分別為81.14%、15.47%和2.99%，與本研究結(jié)果一致。由圖2亦可知，雖然厚壁菌門和放線菌門在各樣品中均存在，但其在各樣品中的含量存在一定的差異，如厚壁菌門在PS3等10個(gè)樣品中相對(duì)含量高達(dá)90%，但其在樣品QJ1和YY2中的相對(duì)含量均低于30%，放線菌門在樣品QJ1和YY2中的相對(duì)含量高達(dá)70%以上，而在PS3、SZ5、WZ2和YY6等樣品中相對(duì)含量均小于1.0%。

2.2.2 基于屬水平鲊廣椒樣品細(xì)菌群落組成分析

在24 個(gè)鲊廣椒樣品中平均相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌屬見(jiàn)圖3。

圖3 基于屬水平鲊廣椒中細(xì)菌菌群多樣性分析結(jié)果Fig.3 Analysis results of bacterial community diversity in zha-chili samples at genus level

由圖3可知，重慶東部地區(qū)鲊廣椒中平均相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌屬有7個(gè)，分別為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）（63.96%）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）（9.70%）、魏斯氏菌屬（Weissella）（9.16%）、乳球菌屬（Lactococcus）（3.15%）、棒桿菌屬（Corynebacterium）（2.96%）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）（1.50%）和腸桿菌屬（Enterobacter）（1.50%）。CAI W C等[20]對(duì)湖北和湖南地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌菌群多樣性進(jìn)行解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬平均相對(duì)含量為74.17%，為樣品中含量最多的細(xì)菌，這與本研究結(jié)果一致，而其研究發(fā)現(xiàn)片球菌屬（Pediococcus）在樣品中的相對(duì)含量亦高達(dá)2.93%，與本研究存在一定的差異，究其原因可能是由于地域環(huán)境、生產(chǎn)工藝或原料存在差異導(dǎo)致的。乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和乳球菌屬（Lactococcus）等乳酸菌廣泛存在于泡菜[21]和酸奶[22]中，在食品的發(fā)酵過(guò)程中起著重要的作用，亦對(duì)成品的品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。有研究表明，乳酸桿菌屬具有耐酸性較強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠代謝碳水化合物產(chǎn)乳酸，可抑制其他雜菌的生長(zhǎng)，從而起到了防腐的效果[23]；魏斯氏菌屬可以代謝產(chǎn)生纖維素，并且在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生部分有機(jī)酸和酯類，提高產(chǎn)品風(fēng)味[24]；乳球菌屬中的乳酸乳球菌（L.lactis）是干酪常用的發(fā)酵劑，能夠?qū)⑷樘寝D(zhuǎn)化產(chǎn)生乳酸，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)水解等作用，從而對(duì)乳制品風(fēng)味產(chǎn)生重要影響[25]。值得關(guān)注的是，隸屬于棒桿菌屬（Corynebacterium）[26]和葡萄球菌屬（Staphylococcus）[27]的部分菌種為條件致病菌，因而在后續(xù)研究中篩選具有鲊廣椒優(yōu)良發(fā)酵特性的乳酸菌并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的乳酸菌純種發(fā)酵，對(duì)提升鲊廣椒的食用安全性具有積極意義。由圖3亦可知，雖然Lactobacillus和Weissella在各樣品中均存在，但其在各樣品中的含量亦存在一定的差異，Lactobacillus在YY6等10個(gè)樣品中相對(duì)含量均＞90%，但其在YY2等6個(gè)樣品中的相對(duì)含量均＜30%，Weissella在樣品QJ2中的相對(duì)含量高達(dá)52.36%，而在WZ2等10個(gè)樣品中相對(duì)含量均＜1.0%。值得一提的是，其他5個(gè)平均相對(duì)含量＞1.0%的細(xì)菌屬并不存在于所有樣品中，這也進(jìn)一步說(shuō)明了重慶東部地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類群構(gòu)成存在較大差異。

由此可見(jiàn)，重慶東部地區(qū)鲊廣椒中蘊(yùn)含了豐富的乳酸菌資源，其乳酸菌類群主要以Lactobacillus、Weissella和Lactococcus為主。

3 結(jié)論

本研究采用純培養(yǎng)和Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)重慶東部地區(qū)鲊廣椒中乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定，同時(shí)對(duì)其細(xì)菌菌群多樣性進(jìn)行解析。純培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)鲊廣椒中可培養(yǎng)乳酸菌以戊糖乳桿菌（L.pentosus）、消化乳桿菌（L.alimentarius）和植物乳桿菌（L.plantarum）為主，3類乳酸桿菌分離株累計(jì)占總分離株總數(shù)的65.57%。高通量測(cè)序結(jié)果表明，平均相對(duì)含量＞1.0%細(xì)菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），平均相對(duì)含量＞1.0%細(xì)菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、魏斯氏菌屬（Weissella）、乳球菌屬（Lactococcus）、棒桿菌屬（Corynebacterium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和腸桿菌屬（Enterobacter），且乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的平均相對(duì)含量為63.96%。