宋德榮， 吳瑛， 林如濤， 單春蘭， 馬金萍，孫忠鑫， 熊艷玲， 劉勇慶， 胡飛飛

1. 畢節(jié)市畜牧獸醫(yī)科學研究所，貴州 畢節(jié) 551700；2. 貴州大學 動物科學學院，貴陽 550025

貴州省位于我國西南地區(qū), 省內綿羊養(yǎng)殖歷史悠久[1], 其中綿羊主產區(qū)有畢節(jié)市威寧縣、 納雍縣等． 貴州省養(yǎng)殖的綿羊主要為地方品種威寧綿羊、 小尾寒羊、 湖羊等． 雖品種較多, 有適應性能優(yōu)良、 抗逆性強等特點, 但大多數地方品種生長速度慢、 繁殖能力低, 已然成為制約地方綿羊養(yǎng)殖產業(yè)發(fā)展的重要因素． 因此, 對省內地方品種進行改良, 培育更加優(yōu)良的新品系, 加快發(fā)展肉羊產業(yè), 對促進現代畜牧業(yè)技術進步、 提高農民收入和改善居民肉類消費結構具有重要意義．

微衛(wèi)星DNA是一類廣泛分布于真核及原核生物基因組中的短串聯(lián)重復序列(1～5 bp), 又稱為簡單重復序列(Short tandem repeats, STRs)或短串聯(lián)重復序列(Simple sequence repeat, SSR), 約占真核基因組的5%, 多存在于基因編碼區(qū)附近, 也存在于基因組中的間隔區(qū)及基因內的外顯子、 內含子和調控區(qū)域． 由于重復單位的重復數量在個體間呈高度變異性且變異數量豐富, 因此微衛(wèi)星座位的應用非常廣泛, 已經發(fā)展成為畜牧業(yè)經濟動物育種領域中常用的分子標記之一[2]． 王婷等[3]在四川省涼山地區(qū)6個綿羊群體的遺傳多樣性研究中, 利用12個微衛(wèi)星座位計算綿羊群體的基因頻率、 有效等位基因數、 雜合度及多態(tài)信息含量, 評估了群體內遺傳多樣度, 進而通過遺傳距離聚類圖、 群體結構推測圖、 主成分分析及群體間分子方差分析等評估群體間遺傳關系． 周建設[4]利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術, 對豬BMP7外顯子及內含子區(qū)域的6個微衛(wèi)星座位多態(tài)性進行檢測, 并對它們的遺傳變異特性及與豬繁殖性狀的相關性進行了分析, 發(fā)現STC,STA與豬繁殖性狀密切相關． 這些研究為開展貴州省畢節(jié)市羊群體微衛(wèi)星座位遺傳多樣性與繁殖性的相關分析提供了參考．

羊FecB(Fecundity Booroola,FecB)基因于1989年被命名, 最明顯的生理效應是增加卵巢中的卵泡數量和排卵數量． 前人研究發(fā)現, 一個拷貝的FecB基因可增加母羊排卵數1.65個[5]． 在表型上, 該基因純合的Booroola母羊(BB型)平均排卵數能達到4.65個, 極顯著高于對照組[2]． 鑒于FecB基因的主要遺傳效應是增加排卵數, 因此國內外學者廣泛關注FecB基因研究． Davis等[6]在中國湖羊和小尾寒羊兩個品種羊基因組中發(fā)現FecB基因突變． 我國學者已對很多地方綿羊品種進行了FecB檢測, 發(fā)現湖羊、 小尾寒羊、 多浪羊和中國美利奴羊也存在FecB基因[7], 同時至少發(fā)現9個品種存在FecB突變[8-9]．

關于FecB基因突變與羔羊出生質量之間的關系已有部分研究． 然而關于FecB微衛(wèi)星座位及與貴州省畢節(jié)市羊群實際產子數的關聯(lián)分析尚不清楚． 因此, 本試驗通過檢測畢節(jié)地區(qū)6個綿羊品種FecB基因6個微衛(wèi)星座位的多態(tài)性, 分析它們在6種羊品種中的多態(tài)分布情況, 并探討微衛(wèi)星座位與羊產羔性能的關系, 以期為FecB基因在貴州省畢節(jié)市羊品種的分子標記輔助育種中提供理論依據．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

湖羊與威寧綿羊雜交品系(HW)55頭、 威寧綿羊(W)30頭、 湖羊(HY)30頭、 薩?？搜蚺c威寧綿羊雜交品系(SW)20頭、 薩?？搜?SFK)30頭、 薩?？搜蚺c半細毛羊雜交品系(SB)20頭的血液及耳組織樣品采自貴州省畢節(jié)市威寧縣、 赫章縣, 并記錄其年產羔羊數; 每只羊無菌采集血液和耳組織樣品后低溫保存帶回實驗室, -20 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.1.2 引物設計與合成

根據GenBank中的FecB序列, 選擇位于綿羊2號染色體FecB區(qū)域可能與繁殖性能相關性較大的6個微衛(wèi)星座位(LSCV043,GC101,471U,Bulge5,BMS2508,300U), 引物由上海生工生物工程技術服務公司合成(表1)．

表1 微衛(wèi)星引物名稱及序列

1.2 方法

1.2.1 基因組的提取

耳組織50 mg或者靜脈血200 μL用于抽提DNA, 提取方法參照天根血液/組織/細胞DNA提取試劑盒說明書進行． 提取樣品DNA后, TE(Tris和EDTA配置而成)溶解, 用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA的純度和體積質量分數, 隨后-20 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.2 PCR反應體系

PCR反應體系為20 μL, 包含Tiangen PCR mix 2×buffer 10 μL, 兩側引物各0.5 μL, DNA模板1 μL, 用ddH2O補足20 μL． PCR反應程序為: 94 ℃預變性5 min, 94 ℃變形30 s, 退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共計30個循環(huán); 再延伸72 ℃ 5 min; 4 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

擴增產物用8%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離, 電泳條件: 在恒壓220 V, 1.0×TBE緩沖液中電泳7～10 h, 硝酸銀染色法顯色后, 用凝膠成像系統(tǒng)拍照并保存．

1.2.4 微衛(wèi)星檢測方法

將染色后的凝膠用凝膠成像系統(tǒng)復制保存, 并利用Kadak Digitial Science ID Image分析軟件根據標準PBR322/MspI Maker計算片段大?。?/p>

1.3 統(tǒng)計分析

等位基因頻率(Allele frequencies): 微衛(wèi)星座位呈等顯性遺傳狀態(tài), 其等位基因頻率根據電泳圖譜統(tǒng)計后獲得; 利用Cervus 3.0 軟件(Cervus公司)統(tǒng)計6個群體不同位點的等位基因數、 期望雜合度、 觀測雜合度和多態(tài)信息含量． 利用SPSS 22.0軟件的線性回歸對不同微衛(wèi)星座位與繁殖性狀進行關聯(lián)分析, 初步確定與繁殖性狀存在顯著差異的位點,p<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義．

2 結果與分析

2.1 6個羊品種微衛(wèi)星多態(tài)位點的等位基因及頻率分析

6對微衛(wèi)星座位引物均能在6個羊群組中穩(wěn)定擴增． 微衛(wèi)星座位的等位基因片段數量及大小如表2所示, 其中微衛(wèi)星座位LSCV043共檢測到4個等位基因, 片段大小為114～160 bp; 微衛(wèi)星座位BMS2508共檢測到6個等位基因, 片段大小為150～190 bp; 微衛(wèi)星座位300U共檢測到5個等位基因, 片段大小為148～178 bp; 微衛(wèi)星座位GC101共檢測到4個等位基因, 片段大小為196～238 bp; 微衛(wèi)星座位Bulge5共檢測到4個等位基因, 片段大小為136～160 bp; 微衛(wèi)星座位471U共檢測到3個等位基因, 片段大小為196～204 bp．

表2 不同微衛(wèi)星座位的等位基因

表3列出了每個微衛(wèi)星座位在6個群體中的等位基因頻率． 所謂優(yōu)勢等位基因, 就是指某特定品種在特定的基因座位上相對集中的等位基因, 優(yōu)勢等位基因集中可能說明該位點為大多數綿羊所共有, 有可能是起源進化最早、 最原始的基因． 從表3中可以看出, 每個位點都占有一定優(yōu)勢的等位基因．

表3 6個微衛(wèi)星座位在6個綿羊群體中的等位基因頻率

各個微衛(wèi)星座位等位基因頻率在不同綿羊群體中具有明顯差異, 對6個綿羊群體6個微衛(wèi)星座位基因頻率的統(tǒng)計結果見表3． 結果顯示, 在微衛(wèi)星座位LSCV043中, 等位基因114 bp在6個綿羊群體中的頻率最高(10.00%～70.00%), 160 bp出現的頻率最低, 且僅在薩?？搜蚣八_福克與半細毛羊雜交品系中出現; 在微衛(wèi)星座位BMS2508中, 等位基因162 bp在6個綿羊群體中出現的頻率最高(16.67%～60%), 156 bp出現的頻率最低, 且未能在湖羊與威寧綿羊雜交品系、 薩福克與威寧綿羊雜交品系及薩?？搜蛑袡z測到; 在微衛(wèi)星座位300U中, 等位基因160 bp在6個綿羊群體中的頻率最高(41.67%～50.00%), 168 bp出現的頻率最低, 且僅在薩?？搜蚺c威寧綿羊雜交品系中檢測到; 在微衛(wèi)星座位GC101中, 等位基因200 bp在6個綿羊群體中的頻率最高(10.00%～50.00%), 238 bp出現的頻率最低, 且未能在威寧綿羊品系中檢測到; 在微衛(wèi)星座位Bulge5中, 等位基因136 bp在6個綿羊群體中的頻率最高(55.00%～63.33%), 146 bp出現的頻率最低, 且未能在薩?？搜蚱废抵袡z測到; 在微衛(wèi)星座位471U中, 等位基因200 bp在6個綿羊群體中的頻率最高(60.00%～90.00%), 196 bp出現的頻率最低, 且未能在威寧綿羊和湖羊品系中檢測到．

2.2 6個羊群組微衛(wèi)星預期雜合度值(He)、 有效等位基因數(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)

6個微衛(wèi)星座位的遺傳指標見表4、 表5、 表6． 微衛(wèi)星座位在群體內多態(tài)性信息含量有一定的差異, 各群體有效等位基因數(Ne)的范圍在1.7～4.01之間, 其中湖羊與威寧綿羊雜交品系在微衛(wèi)星座位BMS2508有最高的有效等位基因數量(4.017 9); 薩?？搜蛟谖⑿l(wèi)星座位471U有最低的有效等位基因數量(1.219 5), 表明貴州省畢節(jié)市綿羊群體存在等位基因差異, 但差異并不明顯．

表4 6個微衛(wèi)星座位在6個羊群體中的有效等位基因數(Ne)

表5 6個微衛(wèi)星座位在6個羊群體中的香農指數

表6 6個微衛(wèi)星座位在6個羊群體中的預期雜合度值(He)

6個微衛(wèi)星位點的香農指數如表5所示, 其數值越大表明群體間多樣性越高． 微衛(wèi)星座位BMS2508在湖羊品系中最高(1.608 9),LSCV043座位在湖羊與威寧綿羊雜交品系中多態(tài)性更好(1.074 0),300U座位在薩?？搜蚺c威寧綿羊雜交品系中最高(1.424 1),GC101座位在薩?？搜蚺c半細毛羊雜交品系中最高(1.329 7)．Bulge5座位在湖羊品系中最高(1.165 5),471U座位在薩?？搜蚺c半細毛羊雜交品系中最高(0.848 7), 該結果進一步提示各羊群品系在6個微衛(wèi)星座位間存在多態(tài)性差異．

6個微衛(wèi)星座位的預期雜合度值(He)如表6所示,LSCV043座位在湖羊與威寧綿羊雜交品系中期最高(0.651 1), 在薩?？搜蚱废抵凶畹?0.48);BMS2508座位在湖羊品系中最高(0.77), 在薩?？搜蚱废抵凶畹?0.48);300U座位在薩?？撕屯幘d羊雜交品系中最高(0.722 2), 在薩?？搜蚱废抵凶畹?0.62);GC101座位在薩福克與半細毛羊雜交品系中最高(0.722 2), 在薩?？搜蚺c威寧綿羊雜交品系中最低(0.611 1);Bulge5座位在湖羊品系中最高(0.625), 在薩?？搜蚱废抵凶畹?0.48);471U座位在薩福克羊與半細毛羊品系中最高(0.493 8), 在薩?？搜蚱废抵凶畹?0.18)． 表6結果提示貴州地方品種及雜交后代遺傳多態(tài)性較高, 而薩福克羊的遺傳多態(tài)性較低, 基因保守型較好．

用多態(tài)信息含量(PIC)可以描述微衛(wèi)星座位的變異程度． 當PIC>0.5時為高度多態(tài)基因座位; 0.250.5);BMS2508座位在除薩?？似废档钠渌废抵? 均屬于高度多態(tài)水平(PIC>0.5);LSCV043座位在各組羊群中均屬于中度多態(tài)基因座位(0.250.5);471U座位在各組羊群中均為中度和低度多態(tài)基因座位．

表7 6個微衛(wèi)星座位在6個羊群體中的多態(tài)信息含量(PIC)

2.3 6個羊群遺傳距離分析

遺傳距離是指兩個群體間的遺傳差異(基因組差異), 但也常用等位基因頻率的函數來度量遺傳差異． 從表8中可知, 湖羊和威寧綿羊雜交品系與湖羊、 威寧綿羊遺傳距離較近, 分別為0.908 8和0.923 5; 薩?？搜?、 半細毛羊與湖羊、 湖羊和威寧綿羊雜交品系及威寧綿羊等遺傳距離較遠．

表8 6個種群標準遺傳距離結果(Nei)

2.4 微衛(wèi)星座位300U,GC101的不同基因型與湖羊和威寧綿羊雜交品系(HW)產羔羊數的關系

微衛(wèi)星座位300U各基因型與湖羊和威寧綿羊雜交品系(HW)產羔羊數的最小二乘平均值±標準誤見表9． 從表9中可以看出, 基因型148/160 bp對應的最小二乘平均值最高, 達到了1.81只, 且與其他基因型差異顯著(p<0.05), 其次是160/164 bp, 也達到了1.53只, 而基因型160/168 bp對應的最小二乘平均值最低, 為1.17只(p<0.05)． 從表10中可以看出, 微衛(wèi)生座位GC101基因型200/238 bp對應的最小二乘平均值最高, 達到了1.74只, 顯著高于196/196 bp、 210/238 bp和200/210 bp(p<0.05), 其次是196/210 bp, 也達到了1.55只, 而基因型200/210 bp對應的最小二乘平均值最低, 為1.27只(p<0.05)．

表9 HW微衛(wèi)星座位300U各基因型與產羔羊數的最小二乘平均值

3 討論

微衛(wèi)星DNA廣泛分布于真核生物基因組中, 具有隨機性、 呈共顯性遺傳、 遵循孟德爾遺傳規(guī)律的特點． 同一個體不同年齡段、 不同組織器官、 皮膚、 毛發(fā)等產生的DNA指紋圖完全一致, 微衛(wèi)星等位基因的差異主要來自核心區(qū)重復單位數目的變化[10]． 本研究涉及的貴州省畢節(jié)市6個品種綿羊共檢測到13個微衛(wèi)星等位基因和40種基因型, 其中BMS2508座位、LSCV043座位、Bulge5座位均為中度或高度多態(tài)位點, 而471U座位在各組羊群中均為中度和低度多態(tài)基因座位, 提示BMS2508座位、LSCV043座位、Bulge5座位可作為篩選羊群基因型的潛在分子標記． 群體多態(tài)信息含量(PIC)和預期雜合度值(He)都能反映群體內個體遺傳變異的程度, 數值高說明遺傳變異大, 反之則群體內的遺傳變異?。?在本研究的 6個綿羊群體中湖羊與威寧綿羊、 薩?？伺c半細毛羊雜交品系的多態(tài)信息含量(PIC)、 預期雜合度值(He)較高, 而湖羊、 威寧綿羊、 薩?？搜蚱废迪鄬^低, 說明貴州省畢節(jié)市雜交羊群較本地純種威寧綿羊的遺傳變異大． 近年來, 不斷有研究者通過雜交選育手段將FecB基因導入繁殖能力較低的羊群中, 以提高經濟效益． 王偉霞等[11]以不含有FecB基因的美利奴羊為父本, 以小尾寒羊公羊與東北細毛羊母羊雜交品系為母本進行雜交, 結果發(fā)現FecB基因對提升后代的產羔性能發(fā)揮重要作用． 張也等[12]以白頭杜泊羊為父本, 以湖羊為母本進行雜交, 結果表明FecB基因對杜湖雜交品系后代母羊的產羔率有影響． 綜上所述,FecB基因總體上對綿羊繁殖性能產生良性影響．

FecB基因是綿羊高繁殖力的一個主效基因, 1993年Montgomery等[13]首先報道FecB基因與微衛(wèi)星基因座位OarAE101和OarHH55緊密連鎖, 遺傳距離分別為13 cM和20 cM． 等位基因數是群體遺傳多樣性分析的重要參數之一, 其數量與樣本含量和研究涉及的座位數有關． 在基因座位數相同的條件下, 樣本量越大, 可檢測到的等位基因數越多． 張林等[14]報道,LSCV043微衛(wèi)星座位98 bp等位基因與小尾寒羊FecB基因B等位基因之間存在一定的連鎖不平衡關系, 證明其是與小尾寒羊多羔主效基因緊密連鎖的一個遺傳標記． 吳舒潔等[15]報道, 小尾寒羊FecB基因B等位基因與471U微衛(wèi)星座位 200 bp等位基因之間存在一定的連鎖不平衡關系． 本研究開展了貴州省畢節(jié)市FecB基因微衛(wèi)星座位多態(tài)性和繁殖性狀統(tǒng)計, 并就二者的相關性進行了分析． 研究發(fā)現, 微衛(wèi)星座位300U在湖羊與威寧綿羊雜交品系中等位基因數為5個, 其中基因型148/160 bp對應的最小二乘平均值最高, 達到了1.81只; 微衛(wèi)星座位GC101基因型200/238 bp對應的最小二乘平均值最高, 達到了1.74只, 可用于初步輔助選擇, 但這部分基因型個體在群體中的比例并不高, 同時產羔羊數在一定程度上還受到環(huán)境、 營養(yǎng)狀況和飼養(yǎng)管理水平的影響． 因此, 微衛(wèi)星座位300U和GC101作為湖羊與威寧綿羊雜交品系繁殖力的分子標記, 尚需要擴大樣本進一步研究．

4 結論

本研究檢測了6種綿羊群體中FecB基因上6個微衛(wèi)星座位的多態(tài)性,300U和GC101可作為篩選羊群繁殖性狀的分子標記, 其中微衛(wèi)星座位300U基因型148/160 bp, 微衛(wèi)星座位GC101基因型200/238 bp與湖羊和威寧綿羊雜交品系產羔羊數的關聯(lián)性最強, 提示其可作為篩選羊群繁殖力的分子標記．