謝梅英，侯連杰

（1.廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510520；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院-清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院，廣東清遠(yuǎn) 511518）

在動(dòng)物生產(chǎn)中，脂肪沉積會(huì)影響母豬繁殖性能，如降低發(fā)情率、受胎率和仔豬出生成活率等[1]。此外，肥胖會(huì)引起飼養(yǎng)動(dòng)物內(nèi)分泌及代謝異常，如代謝率降低、高胰島素血癥和孕酮產(chǎn)生過(guò)剩[2]，伴隨著發(fā)情周期紊亂[3]、多囊卵巢綜合征[4]和不孕癥[5]等。因此，預(yù)防肥胖可以提高畜禽繁殖性能，降低生殖疾病發(fā)病率，改善動(dòng)物繁殖性能。

二氫楊梅素又稱(chēng)蛇葡萄素、白蘞素、雙氫楊梅樹(shù)皮素、雙氫楊梅素等，是一種綠色安全二氫黃酮醇類(lèi)黃酮植物提取物[6]。其廣泛存在于蛇葡萄科蛇葡萄屬植物中，在藤茶中含量可以達(dá)到30%，也存在于楊梅科、杜鵑科、藤黃科等植物中[7]。既往研究證實(shí)，二氫楊梅素通過(guò)激活A(yù)MPK、NRF2 和NF-κB 等通路發(fā)揮抗氧化[8]、抗炎[9]、降血糖及調(diào)血脂等多方面的作用[10-11]。然而，二氫楊梅素是否能夠緩解高脂日糧導(dǎo)致的動(dòng)物發(fā)情周期紊亂尚不清楚。本試驗(yàn)旨在探究二氫楊梅素對(duì)高脂日糧導(dǎo)致的小鼠發(fā)情周期紊亂的影響，研究結(jié)果有望揭示二氫楊梅素在改善肥胖相關(guān)生殖異常方面的調(diào)控作用，為其在改善動(dòng)物繁殖性能和人類(lèi)健康中的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

36 只6 周齡C57B/L6 雌性小鼠（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），在22～28 ℃、60%～80%濕度的條件下，12 h 的光/暗循環(huán)，適應(yīng)1 周后，將小鼠隨機(jī)分為3 組（n=12）：正常日糧組、高脂日糧飲食組和“高脂日糧飲食+二氫楊梅素”組。正常日糧飼喂標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飼料（AIN-93G），高脂日糧飲食組飼喂高脂日糧（脂肪提供60%能量），高脂日糧飲食+二氫楊梅素組飼喂高脂日糧（脂肪提供60%能量）并灌喂200 mg·kg-1體重的二氫楊梅素溶液，正常日糧和高脂日糧飲食組每天灌喂等體積的PBS。試驗(yàn)期18 周，在不同飼養(yǎng)階段，對(duì)小鼠體組成、直腸（體核）溫度和發(fā)情周期等進(jìn)行檢查。試驗(yàn)結(jié)束后，用CO2麻醉小鼠，眼球取血分離血清，用ELISA 試劑盒檢測(cè)雌二醇（estradiol，E2），促卵泡生成素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）水平。

1.2 材料和試劑

二氫楊梅素購(gòu)買(mǎi)自MCE 公司（HY-N0112）。FSH和E2檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 體組成檢測(cè)

從12周齡開(kāi)始每周一上午9:00用動(dòng)物體成分和核磁共振成像系統(tǒng)分析儀（Body Composition Analyzer MiniQMR23-060H-I,Niumag Corporation,Shanghai,China）測(cè)定小鼠的體脂含量和脂肪分布。

1.4 整體代謝

按照綜合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（Promethion metabolic screening systems，美國(guó)Systems International 公司）操作指南，測(cè)定20周齡小鼠的產(chǎn)熱和耗氧量等代謝參數(shù)。

1.5 組織RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)

按照廣州美基生物科技公司RNA 快速提取試劑盒操作說(shuō)明提取腹股溝白色脂肪和肩胛間褐色脂肪RNA。按照TaKaRa 公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明將組織總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 用于后續(xù)定量PCR 實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)操作在本團(tuán)隊(duì)前期發(fā)表研究中均有報(bào)道，相關(guān)基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 qPCR引物序列

1.6 Western Blot檢測(cè)基因的蛋白含量

使用RIPA 裂解液裂解脂肪組織，12 000 r·s-1離心10 min 獲得組織蛋白溶液，使用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后利用Western Blot 檢測(cè)基因的蛋白含量，Western Blot 實(shí)驗(yàn)方法參照本團(tuán)隊(duì)前期發(fā)表研究。

1.7 直腸溫度測(cè)定

從8 周齡開(kāi)始每天用小鼠用直腸探頭連接數(shù)字溫度計(jì)測(cè)量小鼠的直腸溫度。

1.8 發(fā)情周期鑒定

對(duì)20 周齡雌性小鼠連續(xù)8 天進(jìn)行陰道涂片的細(xì)胞學(xué)檢查，每天觀察1 次陰道涂片細(xì)胞類(lèi)型，確定發(fā)情周期所處階段。固定小鼠，用移液槍吸取20 μL PBS至小鼠陰道，反復(fù)抽吸5 次，將液體均勻涂至整個(gè)載玻片，涂片風(fēng)干后，甲醇固定3 min，瑞氏染液染色6 min，PBS 輕柔沖洗，吉姆薩染液染色8 min，最后用自來(lái)水漂洗，自然干燥后封皮檢測(cè)。各階段的分辨方法如下：發(fā)情間期黃體退化，可見(jiàn)大量白細(xì)胞及少量黏膜和上皮細(xì)胞；發(fā)情期卵泡成熟排卵，為無(wú)核角化細(xì)胞包含少量上皮細(xì)胞；發(fā)情前期卵泡快速生長(zhǎng)，可見(jiàn)大量有核上皮細(xì)胞和少量角化細(xì)胞；發(fā)情后期黃體生成，為一半上皮細(xì)胞和一半白細(xì)胞。

1.9 蘇木精&伊紅（H&E）染色

分離內(nèi)臟脂肪，用4%多聚甲醇固定48 h，脫水后用石蠟包埋切片，用蘇木精和伊紅染色并拍照。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析對(duì)各組均值進(jìn)行差異分析，p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 二氫楊梅素對(duì)高脂日糧誘導(dǎo)的小鼠脂肪沉積的影響

與正常日糧相比，18 周的高脂日糧飼喂顯著增加小鼠體增重和小鼠脂肪含量，喂食二氫楊梅素可顯著逆轉(zhuǎn)高脂日糧誘導(dǎo)的體增重和脂肪含量的增加（見(jiàn)圖1A、1B）。與此同時(shí)，內(nèi)臟脂肪的H&E 染色結(jié)果表明：與正常日糧相比，高脂日糧飼喂顯著增加小鼠的內(nèi)臟脂肪細(xì)胞脂質(zhì)蓄積，二氫楊梅素顯著逆轉(zhuǎn)了高脂日糧誘導(dǎo)的內(nèi)臟脂肪細(xì)胞脂質(zhì)累積（見(jiàn)圖1C）。

圖1 喂食二氫楊梅素對(duì)小鼠體增重和脂肪沉積的影響

2.2 二氫楊梅素對(duì)高脂日糧導(dǎo)致的雌性小鼠發(fā)情周期紊亂的影響

與正常日糧相比，高脂日糧誘導(dǎo)肥胖小鼠發(fā)情周期顯著增長(zhǎng)（見(jiàn)圖2A、2B），而且降低發(fā)情期的時(shí)間比例，增加發(fā)情間期的時(shí)間比例（見(jiàn)圖2D）；而喂食二氫楊梅素將小鼠發(fā)情周期恢復(fù)到正常天數(shù)（見(jiàn)圖2B、2C），并且逆轉(zhuǎn)高脂日糧導(dǎo)致的發(fā)情期縮短和發(fā)情間期延長(zhǎng)（見(jiàn)圖2D）。雌二醇和促卵泡激素的ELISA 檢測(cè)結(jié)果表明：肥胖小鼠體內(nèi)雌二醇和促卵泡激素水平顯著降低，二氫楊梅素能夠改善高脂日糧對(duì)血清雌二醇和促卵泡激素水平的抑制作用（見(jiàn)圖2E、2F）。上述結(jié)果表明，二氫楊梅素可以改善高脂日糧導(dǎo)致的雌性小鼠發(fā)情周期紊亂。

圖2 喂食二氫楊梅素對(duì)小鼠發(fā)情周期的影響

2.3 二氫楊梅素對(duì)肥胖雌性小鼠能量代謝的影響

為探究二氫楊梅素緩解高脂日糧導(dǎo)致的發(fā)情周期紊亂是否與提高機(jī)體基礎(chǔ)能力代謝有關(guān)，本研究測(cè)定了喂食二氫楊梅素對(duì)肥胖小鼠的基礎(chǔ)代謝的影響。結(jié)果顯示，高脂日糧降低小鼠的耗氧量和產(chǎn)熱量，而二氫楊梅素逆轉(zhuǎn)了高脂日糧引起的耗氧量和產(chǎn)熱量的降低（見(jiàn)圖3A、3B）。同時(shí)，二氫楊梅素使小鼠的直腸溫度顯著升高，與能量代謝增加的表型一致，表明二氫楊梅素提升肥胖雌性小鼠的能量代謝。

圖3 喂食二氫楊梅素對(duì)小鼠能力代謝的影響

2.4 二氫楊梅素對(duì)肥胖小鼠的棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化相關(guān)基因表達(dá)的影響

由于棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化與增加小鼠產(chǎn)熱密切相關(guān)，因此本試驗(yàn)探究了二氫楊梅素對(duì)棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化的影響。定量PCR 結(jié)果（見(jiàn)圖4）表明：高脂日糧抑制棕色脂肪激活相關(guān)基因UCP1、PGC-1α、Cidea 和PRDM16 的表達(dá)，二氫楊梅素逆轉(zhuǎn)高脂日糧對(duì)棕色脂肪激活相關(guān)基因的抑制作用；WB結(jié)果與qPCR結(jié)果一致。此外，定量PCR結(jié)果表明：高脂日糧抑制腹股溝白色脂肪棕色化轉(zhuǎn)變相關(guān)基因UCP1和PGC-1α mRNA 水平，二氫楊梅素顯著逆轉(zhuǎn)高脂日糧對(duì)腹股溝白色脂肪棕色化轉(zhuǎn)變相關(guān)基因的抑制作用，且WB 結(jié)果與定量PCR 結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，二氫楊梅素促進(jìn)肥胖小鼠的棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化相關(guān)基因表達(dá)。

圖4 二氫楊梅素促進(jìn)肥胖小鼠的棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化相關(guān)基因表達(dá)

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

已有研究表明，肥胖或高脂日糧會(huì)損害包括發(fā)情周期紊亂在內(nèi)的雌性動(dòng)物繁殖性能[12]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)高脂日糧導(dǎo)致雌性小鼠發(fā)情周期紊亂。本研究結(jié)果顯示：小鼠灌服二氫楊梅素可以緩解高脂日糧導(dǎo)致的肥胖小鼠發(fā)情周期紊亂。

雌性動(dòng)物發(fā)情周期是其繁殖過(guò)程的重要組成部分，受生殖激素的嚴(yán)密調(diào)控，不規(guī)律的發(fā)情周期往往伴隨著促卵泡激素和雌二醇等生殖激素水平的紊亂[13]。有研究報(bào)道，肥胖女性血清促卵泡激素和雌激素濃度較低；在嚙齒類(lèi)動(dòng)物中，卵巢切除術(shù)導(dǎo)致肥胖發(fā)生，而補(bǔ)充雌激素可抑制肥胖的發(fā)生[2]。有趣的是，雌激素可抑制動(dòng)物的采食行為，而較低雌激素水平將誘導(dǎo)動(dòng)物采食，進(jìn)一步誘導(dǎo)肥胖[14]。有研究表明，雌性的發(fā)情行為與體脂含量密切相關(guān)；機(jī)體能量平衡和發(fā)情周期受到下丘腦神經(jīng)元的嚴(yán)格調(diào)控，高脂日糧可以穩(wěn)定地提高哺乳動(dòng)物雌二醇水平，雌二醇抑制促性腺激素促黃體生成激素分泌，導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)情表現(xiàn)差[15]。另有研究表明，當(dāng)高脂日糧引起大鼠肥胖時(shí)（體重增加27%），可導(dǎo)致98%的大鼠發(fā)情中斷[16]。本研究中發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素處理后，可顯著升高小鼠雌激素水平，并恢復(fù)小鼠正常的發(fā)情周期。在本研究中發(fā)現(xiàn)高脂日糧誘導(dǎo)肥胖的小鼠體內(nèi)促卵泡激素和雌激素水平顯著降低，二氫楊梅素改善肥胖對(duì)促卵泡激素和雌激素分泌的抑制作用，提示二氫楊梅素可預(yù)防高脂日糧導(dǎo)致的肥胖雌性小鼠生殖激素水平的改變。

本研究還進(jìn)一步解析了二氫楊梅素緩解肥胖引起的發(fā)情周期紊亂的機(jī)制。鑒于肥胖往往伴隨著能量平衡的變化，本研究通過(guò)檢測(cè)小鼠機(jī)體代謝產(chǎn)熱結(jié)果發(fā)現(xiàn)：二氫楊梅素增加了高脂日糧誘導(dǎo)肥胖小鼠的基礎(chǔ)耗氧量和產(chǎn)熱量。由于哺乳動(dòng)物的基礎(chǔ)產(chǎn)熱量的增加主要通過(guò)棕色脂肪和棕色化的白色脂肪中解偶聯(lián)呼吸作用實(shí)現(xiàn)[17]，因此，本研究檢測(cè)了小鼠棕色脂肪和白色脂肪中解偶聯(lián)蛋白UCP1 的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂日糧抑制UCP1 在棕色脂肪和白色脂肪中的表達(dá)，但二氫楊梅素顯著增加UCP1 的表達(dá)。本研究團(tuán)隊(duì)前期證明二氫楊梅素能夠激活PGC-1α 信號(hào)通路抑制肥胖小鼠脂肪組織炎癥反應(yīng)，改善小鼠胰島素敏感性[18]；而PGC-1α 是棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化過(guò)程中重要轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)UCP1 的表達(dá)[19]。本研究也表明：二氫楊梅素可顯著增加棕色脂肪和白色脂肪組織PGC-1α 的表達(dá)，提示二氫楊梅素通過(guò)激活PGC-1α/UCP1信號(hào)通路，促進(jìn)脂肪組織的解偶聯(lián)呼吸作用，增加小鼠代謝產(chǎn)熱，從而改善肥胖引起的發(fā)情周期紊亂。

3.2 結(jié)論

喂食二氫楊梅素可緩解高脂日糧誘導(dǎo)肥胖所導(dǎo)致的小鼠發(fā)情周期紊亂和代謝產(chǎn)熱降低，其可能與棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化產(chǎn)熱相關(guān)。本研究揭示了二氫楊梅素在改善動(dòng)物肥胖相關(guān)的生殖異常方面的潛在應(yīng)用，可為其在人類(lèi)生殖疾病治療和動(dòng)物繁殖性能改善中的應(yīng)用提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。