李文敏　關(guān)闊　李國強(qiáng)　殷蕊　宮春光

摘 要：在蒸餾水+ KH2PO4的環(huán)境條件下進(jìn)行了地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、凝結(jié)芽孢桿菌（B. coagulans）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）和膠凍樣類芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus）對水中無機(jī)磷的去除效果研究，結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌基本不具備除磷能力，解淀粉芽孢桿菌和膠凍樣類芽孢桿菌有一定除磷能力且除磷效果相近，均是從104 CFU/mL開始隨著菌液濃度的增加，除磷效果逐步提高，在107 CFU/mL濃度組達(dá)到最佳除磷效果；同時(shí)除磷效果與水力停留期間隨時(shí)間的演化規(guī)律相似，都是在處理6 h時(shí)基本達(dá)到最佳除磷效果，而6～8 h期間除磷效果明顯降低。

關(guān)鍵詞：無機(jī)磷；解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）；膠凍樣類芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus）；除磷

芽孢桿菌是一類革蘭氏陽性菌，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，多用來調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生態(tài)菌群平衡[1]、促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的生長、防控水產(chǎn)動(dòng)物病害和改善養(yǎng)殖水質(zhì)。已有的研究結(jié)果表明，多種芽孢桿菌具有分解水體有機(jī)質(zhì)、降氮[2-3]、降硫[4]、降磷[5-7]的作用。雖然目前我國尚無養(yǎng)殖尾水排放的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但參考某些已發(fā)布或正在征求意見的地方標(biāo)準(zhǔn)，磷都是水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水排放中的一個(gè)重要監(jiān)測指標(biāo)，例如，山東省《海水養(yǎng)殖尾水排放標(biāo)準(zhǔn)》征求意見稿中，將總磷的指標(biāo)限定為0.2～0.3 mg/L；江蘇省在已發(fā)布《池塘養(yǎng)殖尾水排放標(biāo)準(zhǔn)》中將淡水養(yǎng)殖尾水中總磷的指標(biāo)限定為0.4～0.8 mg/L，海水養(yǎng)殖尾水中總磷的指標(biāo)限定為0.5～1.0 mg/L[8]。本試驗(yàn)通過對水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的5種芽孢桿菌的除磷效果研究，力求找到適宜的除磷添加濃度和水力停留期間除磷效果與時(shí)間的演化規(guī)律，以為更好地設(shè)計(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水處理方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取的5種芽孢桿菌來自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院病害防控實(shí)驗(yàn)室，分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、凝結(jié)芽孢桿菌（B. coagulans）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）和膠凍樣類芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus）。KH2PO4為分析純。

主要實(shí)驗(yàn)儀器有高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、生化培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、烘箱、麥?zhǔn)媳葷醿x、分析天平（萬分之一）、容量瓶、移液槍、離心管、錐形瓶、TP-1A型多參數(shù)水質(zhì)分析儀等。

1.2 試驗(yàn)方法

含磷水樣配制：KH2PO4經(jīng)105 ℃烘干2 h后用蒸餾水溶解、定容，配制成濃度為0.5 mg/L的無機(jī)磷水樣，裝入100 mL錐形瓶中。

菌種活化：分別稱取1 g的各種芽孢桿菌干品，蒸餾水溶解，涂布到LB固體培養(yǎng)基上，生化培養(yǎng)箱中28 ℃活化培養(yǎng)24 h；再次接種到LB固體和液體培養(yǎng)基上，固體培養(yǎng)基生化培養(yǎng)箱28 ℃再次培養(yǎng)24 h，液體培養(yǎng)基搖床28 ℃培養(yǎng)24 h。

菌液配制：挑取菌落，蒸餾水溶解，比濁儀測定麥?zhǔn)蠞岫?，?jì)算出5種芽孢桿菌菌液的濃度，按10倍稀釋法稀釋混勻，配制成104、105、106、107 CFU /mL和108 CFU /mL濃度梯度。

將濃度為108 CFU /mL的5種芽孢桿菌菌液搖勻后用移液槍吸取1 mL菌液分別加入錐形瓶中，對照瓶加1 mL 0.9%生理鹽水，分別于2、4、6、8 h后測定水樣中的無機(jī)磷含量。每個(gè)濃度菌液設(shè)3個(gè)平行，結(jié)果取平均數(shù)。

重復(fù)上述操作，測定加入其他4種濃度梯度菌液后水樣中的無機(jī)磷含量。

本次試驗(yàn)加入各種濃度菌液經(jīng)100 mL蒸餾水稀釋后的最終菌液濃度為102、103、104、106 CFU /mL和106 CFU /mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)結(jié)果

不同濃度的5種芽孢桿菌在2、4、6 h和8 h對無機(jī)磷的去除效果見表1—表5。

2.2 分析

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，5種芽孢桿菌中，解淀粉芽孢桿菌和膠凍樣類芽孢桿菌具有一定除磷作用，而地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的除磷效果非常差，基本不具備除磷能力。解淀粉芽孢桿菌和膠凍樣類芽孢桿菌的除磷效果相近，沒有明顯區(qū)別，均是從104? CFU/mL開始隨著菌液濃度的增加，除磷效果逐步提高，在107 CFU/mL濃度組達(dá)到最佳除磷效果；而108 CFU/mL濃度組的除磷效果有所下降，推測可能與它們的次生代謝產(chǎn)物有關(guān)。解淀粉芽孢桿菌和膠凍樣類芽孢桿菌的除磷效果與水力停留期間隨時(shí)間的演化規(guī)律相似，都是在處理6 h時(shí)基本達(dá)到最佳除磷效果，隨后到8 h時(shí)除磷效果明顯降低。解淀粉芽孢桿菌和膠凍樣類芽孢桿菌在107 CFU/mL濃度組8 h時(shí)，均將無機(jī)磷的濃度從0.5 mg/L降低到0.19 mg/L，以目前已發(fā)布的各省地方標(biāo)準(zhǔn)看，已達(dá)到最嚴(yán)格的限定要求。

本次試驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室中使用蒸餾水完成的，試驗(yàn)環(huán)境相對潔凈，條件單一，試驗(yàn)結(jié)果只能簡單驗(yàn)證解淀粉芽孢桿菌和膠凍樣類芽孢桿菌具有一定除磷效果，而水產(chǎn)養(yǎng)殖中的水環(huán)境則明顯不同，其由多種微生物構(gòu)成的微生態(tài)系統(tǒng)極為復(fù)雜且變化多端，某種細(xì)菌的繁衍增殖受多因素的影響，因此，如何能夠在生產(chǎn)中更好地利用微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖尾水中的磷進(jìn)行有效降解尚需要進(jìn)一步研究。

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Studies on the removal of five Bacillus spp. on inorganic phosphorus in water

LI Wenmin1， GUAN Kuo2， LI Guoqiang1， YIN Rui3， GONG Chunguang4

（1. Cangzhou municipal Aquatic Technology Promotion Station，Cangzhou 061000，China; 2. Chengde municipal Aquatic Technology Promotion Station，Chengde 067000，China; 3. Hebei Academy of Ocean and Fishery Sciences，Qinhuangdao 066200，China; 4. Ocean college of Hebei Agriculture University， Qinhuangdao 066003，China）

Abstract：The removal effect of Bacillus licheniformis， B. coagulans， B. subtilis， B. amyloliquefaciens and Paenibacillus mucilaginosus on inorganic phosphorus in water was studied under the environment of distilled water + KH2PO4. The results showed that B. licheniformis， B. coagulans and B. subtilis basically could not remove phosphorus， while B. amyloliquefaciens and Paenibacillus mucilaginosus have certain phosphorus removal ability and similar phosphorus removal effect. With the concentration increased from 104 CFU/mL onwards， the phosphorus removal effect gradually increased， and the best phosphorus removal effect was achieved at 107 CFU/mL group; meanwhile， their phosphorus removal effect to the evolution law of hydraulic retention period over time was similar， both reaching the max phosphorus removal at 6 h after treatment， while the phosphorus removal effect significantly decreased during 6-8 h.

Key words：inorganic phosphorus; Bacillus amyloliquefaciens; Paenibacilli mucilaginosus; phosphorus removal

（收稿日期：2023-06-24）