黃 蓓, 何水蓮, 李田園, 張 瑩, 田 敏

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所, 浙江 杭州 311400)

蝦脊蘭屬(CalantheR. Br.)隸屬于蘭科(Orchidaceae)擬白及亞族(Subtrib. Bletiinae),為多年生草本植物,全屬約150種,多地生,主要產(chǎn)于長(zhǎng)江流域及其以南省區(qū),部分種類花朵有怡人的清香[1-2]。蝦脊蘭屬全屬皆為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物,峨邊蝦脊蘭(C.yuanaT. Tang et F. T. Wang)為中國(guó)特有種。蝦脊蘭屬植物不僅具有獨(dú)特的觀賞價(jià)值,還具有藥用和食用價(jià)值。

蘭科植物花為天然的花香材料,花香作為其重要特征在觀賞和生殖方面具有獨(dú)特價(jià)值。目前,已對(duì)多種蘭科植物花中揮發(fā)性成分開(kāi)展了研究[3-4]。蝦脊蘭屬植物種間易于雜交,日本已培養(yǎng)出許多園藝栽培品種,花色靚麗奇艷但缺少香氣。中國(guó)部分蝦脊蘭屬植物,如峨邊蝦脊蘭和腎唇蝦脊蘭(C.brevicornuLindl.)花具有明顯的清香,翹距蝦脊蘭(C.aristuliferaRchb. f.)花具有獨(dú)特的幽香,具有較大的開(kāi)發(fā)潛力。探究蝦脊蘭屬不同植物間花朵揮發(fā)性成分的差異,可為后續(xù)蝦脊蘭屬植物花的開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS)技術(shù)對(duì)蝦脊蘭屬中峨邊蝦脊蘭、翹距蝦脊蘭和腎唇蝦脊蘭的花朵和花蕾進(jìn)行了揮發(fā)性成分研究,以期促進(jìn)蝦脊蘭屬植物花香資源的利用與花香育種的發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料峨邊蝦脊蘭、翹距蝦脊蘭和腎唇蝦脊蘭采自中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所后山蘭花培養(yǎng)室,引種自四川阿壩藏族羌族自治州松潘縣。每種選擇5株生長(zhǎng)健壯、正常開(kāi)花的植株為采集對(duì)象,根據(jù)香氣日變化規(guī)律,采集時(shí)間為晴朗日的14:00[5-6]。峨邊蝦脊蘭和翹距蝦脊蘭采摘于2022年3月22日,腎唇蝦脊蘭采摘于2022年4月8日,每種采摘3或4支正常生長(zhǎng)且發(fā)育狀態(tài)相似的花葶。花葶采摘后立即水培養(yǎng)護(hù),并盡快摘取花蕾(萼片和花瓣完全未展開(kāi))和花朵(花瓣和萼片完全展開(kāi))進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每種摘取花蕾和花朵各15個(gè)。

主要儀器和試劑:6890N-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司);SPME手動(dòng)進(jìn)樣器(美國(guó)Supelco公司);50/30 μm PDMS/DVB/CAR萃取纖維(美國(guó)Supelco公司);色譜柱DB-5MS(60 m×0.25 mm,0.25 μm,美國(guó)Supelco公司);10 μg·mL-1癸酸乙酯溶液(內(nèi)標(biāo)物)(德國(guó)Dr. E公司)。

1.2 方法

頂空固相微萃取前處理:稱取1 g樣品于15 mL頂空瓶中,加入50 μL內(nèi)標(biāo)物,用具硅膠隔墊的頂空螺紋蓋蓋緊,在35 ℃烘箱中平衡5 min后,將萃取頭插入頂空瓶,于樣品上空吸附43 min,最后在氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)樣口于220 ℃下解吸5 min。

氣相色譜條件:升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃,保持2 min;以3 ℃·min-1速率升溫至80 ℃,保持 2 min;以5 ℃·min-1速率升溫至180 ℃,保持1 min;以10 ℃·min-1速率升溫至230 ℃,保持5 min;最后以20 ℃·min-1速率升溫至250 ℃,保持 4 min。進(jìn)樣口溫度220 ℃。脈沖不分流,載氣為高純氦氣(純度99.999%),柱流速1.5 mL·min-1。

質(zhì)譜條件:氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀接口溫度250 ℃;離子源溫度230 ℃;離子化方式EI;電子能量70 eV;掃描質(zhì)量范圍50～500 amu。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)

利用NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行檢索匹配與碎片比對(duì),結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和各成分的相對(duì)保留時(shí)間等進(jìn)行定性分析,確認(rèn)供試材料花香中的揮發(fā)性成分。根據(jù)加入樣品和內(nèi)標(biāo)物的峰面積計(jì)算樣品中揮發(fā)性成分總含量,采用峰面積歸一化法[7]計(jì)算各揮發(fā)性成分的相對(duì)含量。利用EXCEL 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和整理。

2 結(jié)果和分析

峨邊蝦脊蘭、翹距蝦脊蘭和腎唇蝦脊蘭花蕾和花朵中共檢測(cè)到揮發(fā)性成分137種。峨邊蝦脊蘭花蕾和花朵中揮發(fā)性成分總含量分別為1.89和1.31 μg·g-1,翹距蝦脊蘭花蕾和花朵中揮發(fā)性成分總含量分別為1.19和5.10 μg·g-1,腎唇蝦脊蘭花蕾和花朵中揮發(fā)性成分總含量分別為0.26和0.84 μg·g-1。

蝦脊蘭屬3種植物花蕾和花朵中揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量和相對(duì)含量見(jiàn)表1。由表1可以看出:與花蕾相比,峨邊蝦脊蘭、翹距蝦脊蘭和腎唇蝦脊蘭花朵中揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量均較多,分別增加21、29和27種。

表1 蝦脊蘭屬3種植物花蕾和花朵中揮發(fā)性成分的數(shù)量和相對(duì)含量1)

進(jìn)一步分析結(jié)果顯示:峨邊蝦脊蘭花蕾中主要揮發(fā)性成分為羅勒烯,相對(duì)含量為63.75%;花朵中主要揮發(fā)性成分為十三烯、芳樟醇、己酸己酯和羅勒烯,相對(duì)含量分別為20.44%、15.95%、12.81%和12.47%。與花蕾相比,峨邊蝦脊蘭花朵中酯類、酮類、酚類、芳香烴類和烷烴類成分的數(shù)量和相對(duì)含量均有不同程度的增加;萜烯類成分的數(shù)量雖然有所增加,但相對(duì)含量明顯降低。翹距蝦脊蘭花蕾中主要揮發(fā)性成分為β-蒎烯和羅勒烯,相對(duì)含量分別為48.11%和9.87%;花朵中主要揮發(fā)性成分也為β-蒎烯和羅勒烯,相對(duì)含量分別為26.55%和36.54%。與花蕾相比,翹距蝦脊蘭花朵中萜烯類成分的數(shù)量和相對(duì)含量均明顯增加;酯類成分的數(shù)量明顯增加,但相對(duì)含量明顯降低。腎唇蝦脊蘭花蕾中萜烯類成分的數(shù)量最多(27種),相對(duì)含量也最高(73.39%),主要揮發(fā)性成分為D-檸檬烯(相對(duì)含量為25.59%);花朵中也是萜烯類成分的數(shù)量最多(29種),但其相對(duì)含量(8.39%)較花蕾明顯降低;花朵中酯類成分的相對(duì)含量最高(71.10%),其數(shù)量較花蕾明顯增加,主要揮發(fā)性成分為丙位辛內(nèi)酯(相對(duì)含量為48.01%)。

3 討 論

供試蝦脊蘭屬3種植物花蕾和花朵中揮發(fā)性成分豐富,種間存在一定差異。與花蕾相比,蝦脊蘭屬3種植物花朵中揮發(fā)性成分的數(shù)量明顯增多,且實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)花朵的香氣層次也明顯增加,推測(cè)花部的開(kāi)放狀態(tài)與揮發(fā)性成分緊密相關(guān)。蕙蘭(CymbidiumfaberiRolfe)在盛開(kāi)期的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量明顯多于花蕾期、半開(kāi)期和衰敗期[8],春蘭〔Cymbidiumgoeringii(Rchb. f.) Rchb. f.〕花朵中萜烯類成分的數(shù)量和含量也都高于花蕾[9]。已有研究結(jié)果[10-12]顯示:蘭科植物花中的揮發(fā)性成分多以萜烯類、醇類、酯類和烷烴類為主。本研究中,峨邊蝦脊蘭和翹距蝦脊蘭花蕾和花朵以及腎唇蝦脊蘭花蕾中揮發(fā)性成分均為萜烯類成分的數(shù)量最多,且相對(duì)含量也最高;與花蕾相比,腎唇蝦脊蘭花朵揮發(fā)性成分中丙位辛內(nèi)酯的相對(duì)含量急劇升高,酯類成分的相對(duì)含量最高,而萜烯類成分的數(shù)量雖有所增加且為最多,但相對(duì)含量下降了65個(gè)百分點(diǎn)。此外,從感官體驗(yàn)來(lái)看,腎唇蝦脊蘭和峨邊蝦脊蘭的花蕾和花朵的香氣皆為清香,且持香時(shí)間長(zhǎng),而翹距蝦脊蘭的花蕾無(wú)香,花朵的香氣為似有若無(wú)的幽香,推測(cè)與其特有的揮發(fā)性成分有關(guān),但具體原因需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

蘭科植物花部結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,萼片、花瓣、唇瓣和合蕊柱等不同部位的香氣存在差異[13]。本研究中得到的揮發(fā)性成分總含量較低可能是由于蝦脊蘭屬植物花部香氣釋放的主要部位尚未確定而采用全花作為樣本,后期將對(duì)花香氣釋放的主要部位進(jìn)行進(jìn)一步研究。另外,中國(guó)蝦脊蘭屬植物資源豐富,蝦脊蘭屬其他植物的揮發(fā)性成分也有待進(jìn)一步研究。