李彥松,孫 乙,朱玉廣,鐘瑩瑩

目的:探討缺氧條件下Wnt/β-catenin通路在晶狀體上皮細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中的作用,分析Dickkopf-1(DKK-1)的表達對晶狀體上皮細胞EMT的影響。

方法:將體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞(HLEB3細胞)分為正常氧培養(yǎng)組(加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液)和缺氧培養(yǎng)組(加入含100μmol/L CoCl2溶液的培養(yǎng)液進行缺氧處理6、12、24、48h)。利用免疫熒光染色法檢測Wnt3a和DKK-1蛋白的表達及β-catenin蛋白的表達和定位;利用qRT-PCR法檢測DKK-1 mRNA的表達。

結(jié)果:免疫熒光染色結(jié)果顯示,隨著缺氧時間的延長,HLEB3細胞中Wnt3a和DKK-1蛋白表達水平明顯上調(diào),β-catenin蛋白在細胞核內(nèi)積聚逐漸增多。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,與正常氧培養(yǎng)組相比較,缺氧培養(yǎng)6h組細胞中DKK-1 mRNA無顯著差異(P>0.05),而缺氧培養(yǎng)12、24、48h組細胞中DKK-1 mRNA表達明顯增加(P<0.001)。

結(jié)論:缺氧可以激活晶狀體上皮細胞Wnt/β-catenin通路,并誘導(dǎo)Dickkopf-1的表達,參與調(diào)控Wnt/β-catenin通路,影響EMT進程。

?KEYWORDS：Wnt/β-catenin signaling pathway; Dickkopf-1 (DKK-1); hypoxia; lens epithelial cells; transdifferentiation

0 引言

后囊膜混濁(posterior capsular opacification,PCO),又稱后發(fā)性白內(nèi)障,是白內(nèi)障術(shù)后主要的一種并發(fā)癥,發(fā)生于白內(nèi)障術(shù)后或晶狀體外傷后,由于殘留的晶狀體皮質(zhì)或晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells,LECs)發(fā)生增殖,形成混濁,使患者的視力再次下降,是影響白內(nèi)障術(shù)后患者視力恢復(fù)的一個重要因素[1]。正常情況下,LECs位于晶狀體前部,處于富氧區(qū),而白內(nèi)障術(shù)后晶狀體囊袋內(nèi)殘留的LECs由前部富氧區(qū)移行至晶狀體后部的缺氧微環(huán)境中,在缺氧、炎癥因子等刺激下,LECs在數(shù)小時內(nèi)開始發(fā)生增殖、遷移和轉(zhuǎn)分化過程[2]。既往研究發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)Wnt3a過表達能夠促進LECs的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程,激活核內(nèi)靶基因C-myc和Cyclin D1的表達,促進LECs增殖[3]。在體外培養(yǎng)的LECs中加入外源性Dickkopf-1(DKK-1)后發(fā)現(xiàn),β-catenin核轉(zhuǎn)移明顯減少,下游核內(nèi)靶基因C-myc和Cyclin D1的表達明顯下降,證實外源性應(yīng)用DKK-1能夠抑制經(jīng)典Wnt通路,抑制LECs的EMT過程[4]。但在缺氧條件下,經(jīng)典Wnt通路能否激活并發(fā)揮作用尚未見報道。本研究旨在探討缺氧條件下Wnt/β-catenin通路在LECs的EMT過程中的作用,分析DKK-1表達對LECs的EMT過程的影響。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞人晶狀體上皮細胞(HLEB3細胞)購買于深圳市豪地華拓生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑和儀器設(shè)備主要試劑:DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司),胎牛血清(FBS,杭州四季青公司),氯化鈷六水合物(Sigma公司),兔抗人Wnt3a單克隆抗體、兔抗人β-catenin單克隆抗體(Abcam公司),DKK-1重組兔單克隆抗體(Thermo Fisher Scientific),Alexa Fluor 488標記親和純化山羊抗兔IgG(H+L)二抗(Abways公司),Trizol RNA提取液(Biosharp公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)。主要儀器設(shè)備:CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific),倒置相差照相顯微鏡、熒光顯微鏡(OLYMPUS)。

1.2方法

1.2.1 HLEB3細胞培養(yǎng)及傳代快速解凍保存于液氮的HLEB3細胞,加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液,吹打混勻后培養(yǎng),1～2d更換1次培養(yǎng)液,融合度達80%時,胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 HLEB3細胞缺氧模型的構(gòu)建取處于對數(shù)生長期的HLEB3細胞,胰蛋白酶消化后,加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h,觀察細胞貼壁后去培養(yǎng)液,加入濃度為100μmol/L的CoCl2溶液,置于37℃,5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。

1.2.3劃痕實驗觀察細胞遷移能力取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HLEB3細胞,傳代后以每孔1×106個細胞均勻接種于6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi),置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,使用高壓滅菌后的200μL槍頭在6孔板上劃痕,正常氧培養(yǎng)組加入10% FBS的DMEM培養(yǎng)液,缺氧培養(yǎng)組加入含100μmol/L CoCl2溶液的培養(yǎng)液,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每組設(shè)置2個復(fù)孔。于劃痕后0、24h時分別在倒置顯微鏡下拍照記錄各組細胞劃痕之間的距離及細胞形態(tài),計算細胞遷移率。細胞遷移率=(0h劃痕距離-24h劃痕距離)/0h劃痕距離×100%。在同等實驗條件下重復(fù)3次。

1.2.4免疫熒光法測定Wnt3a和β-catenin及DKK-1蛋白的表達取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HLEB3細胞,傳代后以每孔1×104個細胞均勻接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,正常氧培養(yǎng)組加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液,缺氧培養(yǎng)組加入含100μmol/L CoCl2溶液的細胞培養(yǎng)液,分別培養(yǎng)6、12、24、48h后,行免疫熒光染色。4%多聚甲醛室溫下固定20min,0.3% Triton X-100通透10min,10%山羊血清室溫下封閉30min,每孔滴加足夠量的一抗(稀釋比例:Wnt3a 1∶100、β-catenin 1∶250、DKK-1 1∶100),每組設(shè)置5個復(fù)孔,37℃孵育2h后置于4℃孵育過夜。在暗室中滴加熒光二抗37℃孵育30min,滴加DAPI孵育5min,加入抗熒光淬滅劑進行封片,熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,為確保染色強度比較的有效性,對于同一蛋白的測定使用相同配置進行成像。所有實驗在同等實驗條件下重復(fù)3次,應(yīng)用Image J軟件對實驗結(jié)果進行分析。

1.2.5 qRT-PCR檢測DKK-1mRNA的表達取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HLEB3細胞傳代后接種于6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁后用PBS沖洗,正常氧培養(yǎng)組加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液,缺氧培養(yǎng)組加入含100μmol/L的CoCl2培養(yǎng)基進行缺氧處理6、12、24、48h后,采用Trizol RNA提取液提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)。PCR引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30s;95℃變性5s,60℃退火及延伸30s,40個循環(huán);最后60℃～95℃融解。采用2-ΔΔCt法計算DKK-1 mRNA的相對表達量。

表1 引物序列

統(tǒng)計學(xué)分析:應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗結(jié)果進行分析。所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性分布及方差齊性檢驗,服從正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差的形式表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1缺氧對晶狀體上皮細胞遷移能力的影響劃痕實驗結(jié)果顯示,正常氧培養(yǎng)組和缺氧培養(yǎng)組細胞遷移率分別為(14.54±3.66)%、(14.71±4.52)%,兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.18,P=0.86)。觀察兩組細胞遷移運動發(fā)現(xiàn),兩組細胞遷移率未見顯著差異,但缺氧培養(yǎng)組個別細胞運動隨意,表現(xiàn)出單個細胞遷移運動;觀察兩組細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),正常氧培養(yǎng)組細胞排列規(guī)則,表現(xiàn)為規(guī)則的梭形,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,但缺氧培養(yǎng)組部分細胞胞體延長伸展,細胞呈現(xiàn)極性(圖1)。

圖1 劃痕實驗觀察HLEB3細胞運動遷移情況。

2.2缺氧對晶狀體上皮細胞Wnt3a蛋白表達的影響免疫熒光檢測結(jié)果顯示,與正常氧培養(yǎng)組相比,隨著缺氧處理時間延長,Wnt3a蛋白表達明顯上調(diào),在細胞內(nèi)的分布明顯增加(圖2)。正常氧培養(yǎng)組、缺氧培養(yǎng)(6、12、24、48h)組細胞中Wnt3a蛋白平均熒光強度分別為1.35±0.41、1.58±0.21、2.53±0.54、2.89±0.55、3.59±0.65。

圖2 免疫熒光法檢測HLEB3細胞中Wnt3a蛋白的表達情況 藍色:DAPI染料進行的DNA核染色;綠色:Wnt3a蛋白表達陽性;Merge:融合圖像。

2.3缺氧對晶狀體上皮細胞DKK-1蛋白表達的影響免疫熒光檢測結(jié)果顯示,與正常氧培養(yǎng)組相比,隨著缺氧處理時間的延長,DKK-1蛋白在細胞內(nèi)的表達上調(diào)(圖3)。正常氧培養(yǎng)組、缺氧培養(yǎng)(6、12、24、48h)組細胞中DKK-1蛋白平均熒光強度分別為0.66±0.12、0.74±0.21、0.82±0.18、0.98±0.19、1.42±0.13。

圖3 免疫熒光法檢測HLEB3細胞中DKK-1蛋白的表達情況 藍色:DAPI染料進行的DNA核染色;綠色:DKK-1蛋白表達陽性;Merge:融合圖像。

2.4缺氧對晶狀體上皮細胞β-catenin蛋白表達的影響免疫熒光檢測結(jié)果顯示,β-catenin蛋白在正常氧培養(yǎng)組細胞中幾乎均位于細胞漿中;缺氧培養(yǎng)6h后,β-catenin蛋白在細胞漿和細胞膜上表達增強;缺氧培養(yǎng)24h后,β-catenin蛋白表達明顯上調(diào),并逐漸向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,隨著缺氧處理時間的延長,細胞核內(nèi)積聚逐漸增多;缺氧培養(yǎng)48h后,β-catenin蛋白在細胞漿、細胞膜及細胞核內(nèi)均有表達(圖4)。

圖4 免疫熒光法檢測HLEB3細胞中β-catenin蛋白的表達情況 藍色:代表DAPI染料進行的DNA核染色;綠色:β-catenin蛋白表達陽性;Merge:融合圖像。

2.5缺氧對晶狀體上皮細胞DKK-1mRNA表達的影響qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,正常氧培養(yǎng)組、缺氧培養(yǎng)(6、12、24、48h)組細胞DKK-1 mRNA相對表達水平分別為1.01±0.15、1.29±0.15、2.15±0.11、2.99±0.23、5.21±0.23,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=259.55,P<0.001),與正常氧培養(yǎng)組相比,缺氧培養(yǎng)6h組細胞DKK-1 mRNA表達少量增加,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.088),而缺氧培養(yǎng)12、24、48h組細胞DKK-1 mRNA表達量明顯增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

3 討論

PCO是影響白內(nèi)障術(shù)后視力的一種主要并發(fā)癥,主要作用機制是白內(nèi)障術(shù)后殘留的LECs發(fā)生了EMT[5]。LECs為單層立方上皮,位于晶狀體前囊膜及赤道部囊膜下,細胞與細胞之間通過縫隙連接和橋粒等連接緊密結(jié)構(gòu)形成屏障,阻擋大分子物質(zhì)進出細胞。正常情況下,晶狀體的前部由含氧量較高的房水供氧,晶狀體后部由含氧量較低的玻璃體供氧,白內(nèi)障術(shù)后LECs遷移至晶狀體后部相對缺氧的微環(huán)境中,開始發(fā)生增殖、轉(zhuǎn)分化的過程。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在LECs培養(yǎng)液中分別加入0、25、50、100、200、400μmol/L CoCl2溶液,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h后,采用CCK-8法檢測細胞存活率,結(jié)果顯示在含100μmol/L CoCl2溶液的培養(yǎng)液中細胞存活率更高[6]。本研究選擇100μmol/L CoCl2作用于HLEB3細胞,建立LECs缺氧模型,模擬正常機體中LECs的缺氧微環(huán)境。

細胞遷移是活細胞廣泛存在的一種運動形式,是指細胞在受到某些信號刺激后而產(chǎn)生的移動[7]。晶狀體在白內(nèi)障術(shù)后發(fā)生創(chuàng)傷愈合反應(yīng),殘留的LECs發(fā)生增殖、遷移、EMT及膠原沉積等過程,由富氧的晶狀體前部移行至缺氧的晶狀體后部,最終形成皺褶,使后囊膜混濁。細胞劃痕實驗是比較經(jīng)典的體外細胞遷移實驗,本研究發(fā)現(xiàn),缺氧處理后的LECs與正常氧培養(yǎng)組細胞遷移率未見明顯差異(P>0.05),僅表現(xiàn)為個別細胞胞體延長伸展,細胞呈現(xiàn)極性,出現(xiàn)個別細胞遷移的隨意運動。由此認為缺氧誘導(dǎo)的Wnt信號通路在EMT初期并非發(fā)揮主要作用。這與陳曦[8]研究結(jié)論相符,雖然Wnt/β-catenin通路在PCO發(fā)展過程中被激活,但在疾病發(fā)展的不同階段,表達水平和激活狀態(tài)不同,隨著時間的延長表達不斷增加。Wang等[9]研究也發(fā)現(xiàn),隨著時間的推移,白內(nèi)障模型鼠晶狀體摘除術(shù)后殘留的LECs中Wnt表達上調(diào)。

Wnt信號通路是細胞內(nèi)一條非常重要的信號傳導(dǎo)通路,不僅在胚胎形成、發(fā)育過程中發(fā)揮作用,并且能夠調(diào)節(jié)干細胞的分化和自我更新過程[10],主要包括1條經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路及2條非經(jīng)典平面細胞極性(PCP)信號通路和Wnt/Ca2+信號通路[11],其中研究最多的是Wnt/β-catenin信號通路,其異常激活與癌癥的發(fā)生、代謝紊亂等多種疾病密切相關(guān)[12],由于眾多Wnt蛋白在眼內(nèi)均有表達,因此在眼睛器官發(fā)育中Wnt/β-catenin信號通路也起著不可或缺的作用,可以調(diào)控眼部組織的正常發(fā)育。β-catenin是一種多功能蛋白,在細胞中有雙重作用,其不僅參與Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)錄,還通過與細胞骨架的相互作用在細胞的黏附連接中發(fā)揮作用。β-catenin與細胞漿α-catenin結(jié)合形成復(fù)合物,將膜鈣黏蛋白與肌動蛋白細胞骨架連接起來發(fā)揮作用[13]。Wnt/β-catenin信號通路未激活時,β-catenin以發(fā)揮黏附作用為主,在細胞內(nèi)維持低水平狀態(tài),從而抑制Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。而當Wnt配體通過與LRP5/6和Fz等跨膜受體結(jié)合時,激活細胞內(nèi)的酪氨酸激酶,阻止β-catenin磷酸化,促使其在細胞漿內(nèi)逐漸積累,當積累到一定程度時向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF1成員,促進下游靶基因如CD44、C-myc、Cyclin D1和基質(zhì)金屬蛋白酶等的轉(zhuǎn)錄和表達,抑制細胞黏附,促進細胞的EMT轉(zhuǎn)變,從而影響細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及干細胞分化的能力[14-18]。β-catenin的核轉(zhuǎn)移與細胞增殖、分化和運動密切相關(guān),由于能夠結(jié)合鈣黏蛋白,因此β-catenin的核轉(zhuǎn)移也是間充質(zhì)改變的標志之一。

DKK-1是一種分泌型糖蛋白,DKK家族包括4種不同的形式(DKK-1、DKK-2、DKK3和DKK-4)。DKK-1的研究最為成熟,其在許多組織中廣泛表達,包括成骨細胞和骨細胞、皮膚、前列腺、胎盤和內(nèi)皮等[19-20]。不僅是Wnt信號通路的拮抗劑,也是Wnt/β-catenin信號通路的下游信號分子,Wnt信號通路的激活會導(dǎo)致DKK-1自身表達增加,并參與Wnt信號通路的負性調(diào)節(jié)[21]。DDK-1拮抗Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮抑制作用主要通過兩方面:(1)DKK-1直接與LRP5/6結(jié)合,阻止其合成FZD-Wnt-LRP5/6三聚體,進而阻止細胞內(nèi)酪氨酸激酶的激活;(2)通過減少LRP5/6發(fā)揮作用,DKK-1與另一種受體Kremen1/Kremen2結(jié)合,三者之間形成三聚體,誘導(dǎo)細胞發(fā)揮內(nèi)吞作用,使LRP5/6數(shù)量減少,Wnt蛋白活性受到明顯抑制,不能向細胞內(nèi)傳導(dǎo),進而影響下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[22],以此抑制經(jīng)典的Wnt通路活化。劉婷婷[23]研究建立PCO兔模型,發(fā)現(xiàn)DKK-1可以抑制Wnt3a誘導(dǎo)的EMT和LECs遷移能力。

本研究通過對HLEB3細胞進行缺氧處理,利用免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),隨著缺氧處理時間的延長,Wnt3a蛋白表達上調(diào),表明缺氧條件下Wnt/β-catenin通路激活,且隨著缺氧處理時間的延長,β-catenin表達不斷增加,在細胞膜、細胞漿內(nèi)逐漸積聚,并逐漸轉(zhuǎn)移到細胞核中,證實LECs發(fā)生了EMT。本研究還發(fā)現(xiàn),隨著缺氧處理時間的延長,DKK-1 mRNA及蛋白表達增加,其中DKK-1蛋白為弱陽性表達,說明缺氧激活了Wnt/β-catenin信號通路,其下游的信號分子DKK-1表達增強,影響晶狀體上皮細胞EMT進程。但尚未發(fā)現(xiàn)隨著DKK-1表達的增強而β-catenin入核減少,考慮DKK-1作為一種下游分子,少量表達后尚不足以抑制大量表達的Wnt3a蛋白的激活作用,因此本研究中發(fā)現(xiàn)β-catenin蛋白能夠持續(xù)表達并入核,而張利民[24]研究發(fā)現(xiàn),外源性加入Wnt抑制劑DKK-1后能夠抑制β-catenin的核轉(zhuǎn)移及下游β-catenin/TCF信號通路靶基因C-myc和Cyclin D1的表達,證實能夠抑制LECs增殖,我們也將進行后續(xù)實驗繼續(xù)研究。

綜上所述,缺氧可以誘導(dǎo)LECs的Wnt/β-catenin通路激活,參與LECs的EMT過程,并誘導(dǎo)DKK-1表達,這為尋求有效抑制白內(nèi)障術(shù)后PCO提供了新靶點。