閆秀麗,王 欽,陸相慶

目的:探討Toll樣受體4(TLR4)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)在糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)患者血清中的表達(dá)情況及臨床意義。

方法:選取2021-01/2022-01本院收治的183例2型糖尿病(T2DM)患者為研究對象,分為非糖尿病視網(wǎng)膜病變(NDR)組(54例),增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)組(68例)和非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(NPDR)組(61例)。同期按照年齡、性別分層隨機(jī)選擇70例于本院進(jìn)行健康體檢志愿者作為對照組。出院后隨訪1a,根據(jù)DR患者是否發(fā)生視力殘疾,分為預(yù)后不良組(40例)與預(yù)后良好組(89例)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清中TLR4、VEGFA水平;通過Logistic回歸分析DR發(fā)生的影響因素;利用受試者工作特征曲線(ROC)分析血清TLR4、VEGFA水平診斷DR及預(yù)測預(yù)后的臨床價(jià)值。

結(jié)果:對照組、NDR組、PDR組和NPDR組間TLR4、VEGFA水平比較均具有差異(F=935.753、516.936,均P<0.05),各組兩兩比較均具有差異(P<0.05)。預(yù)后不良組患者血清中TLR4、VEGFA表達(dá)水平均高于預(yù)后良好組(P<0.01)。Logistic回歸分析結(jié)果顯示,TLR4、VEGFA、病程、HbA1c均是DR發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05);ROC結(jié)果顯示,血清TLR4、VEGFA水平及二者聯(lián)合預(yù)測DR的AUC分別為0.869、0.862、0.931,血清TLR4、VEGFA水平及二者聯(lián)合預(yù)測DR患者視力殘疾的AUC分別為0.864、0.863、0.938。

結(jié)論:DR患者血清中TLR4、VEGFA表達(dá)均上調(diào),二者聯(lián)合檢測可作為評估DR發(fā)生及預(yù)后不良的潛在指標(biāo)。

?KEYWORDS：diabetic retinopathy; Toll-like receptor 4 (TLR4); vascular endothelial growth factor A (VEGFA)

0 引言

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種伴多種并發(fā)癥的代謝綜合征,近幾十年來在世界范圍內(nèi)的患病率呈上升趨勢[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是DM的主要并發(fā)癥,可導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管異常和嚴(yán)重的視力損害[2-3]。DR發(fā)病的確切分子機(jī)制尚不清楚,治療選擇也有限[4]。因此,迫切需要發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和發(fā)展早期檢測方法來治療和預(yù)防DR。血清Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)是Toll樣受體家族(toll-like receptor,TLR)蛋白的一員,是促炎反應(yīng)的主要參與者[5]。研究發(fā)現(xiàn)TLR4與2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)患者微血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系[6]。血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)是一種血管生成的主要激活劑,被認(rèn)為通過誘導(dǎo)新生血管和增加視網(wǎng)膜血管的通透性來發(fā)揮重要作用[7]。兩種因子均與DR相關(guān),但二者對DR的診斷及預(yù)后價(jià)值尚不明確?；诖?本研究旨在通過檢測TLR4、VEGFA在DR患者中的表達(dá)情況,分析TLR4、VEGFA與DR發(fā)展及預(yù)后預(yù)測的作用,旨在為DR的早期預(yù)防和治療提供參考依據(jù)。

1 對象和方法

1.1對象選取2021-01/2022-01本院收治的183例T2DM患者為研究對象,根據(jù)有無DR分為DR組(129例)和非糖尿病視網(wǎng)膜病變(NDR)組(54例),根據(jù)DR的國際臨床分類將DR患者分為增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)組(68例)和非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)組(61例)。同期按照年齡、性別分層隨機(jī)選擇70例于本院進(jìn)行健康體檢志愿者作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];(2)使用光學(xué)相干斷層掃描和眼底熒光血管造影檢查T2DM患者,診斷是否存在DR[9];(3)患者均為雙眼發(fā)病。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)孕期、哺乳期或兩者兼而有之的非糖尿病原因?qū)е碌囊暳适?(2)診斷為癌癥、免疫系統(tǒng)疾病;(3)合并其他眼部疾病者,如視網(wǎng)膜血管阻塞、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、血液病或糖尿病眼底病變,視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜腫瘤或其他相關(guān)疾病;(4)使用抗代謝物或免疫抑制劑;(5)臨床資料不完整者。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并向入組受試者告知研究情況并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集從每位同意的患者身上采集大約10mL空腹靜脈血,放入血清分離管。血液樣品凝固30min,然后在固定角度離心機(jī)中以1300×g離心15min。然后分離血清,并立即在-80℃保存,以待進(jìn)一步研究。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中TLR4和VEGFA水平采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)根據(jù)制造商的說明,使用TLR4(貨號(hào)EK-H10214,EK-Bioscience)和VEGFA檢測試劑盒(貨號(hào)KIT11066,Sino Biological Inc.)測定TLR4、VEGFA的水平。

1.2.3臨床資料收集及生化指標(biāo)測定從我院病歷管理系統(tǒng)中收集患者的姓名、性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、住院次數(shù)、糖尿病病程、糖尿病家族史、身高、體質(zhì)量、收縮壓和舒張壓(入院當(dāng)天,充分休息后,由我科護(hù)士用電子血壓計(jì)測量血壓)等資料。采用全自動(dòng)生化分析儀測定血清糖脂代謝指標(biāo),包括空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平,采用放射免疫法測定空腹胰島素(fasting insulin,FINS)水平。

1.2.4預(yù)后隨訪DR患者均進(jìn)行規(guī)范化治療,治療方法參考《我國糖尿病視網(wǎng)膜病變臨床診療指南(2014年)》[9]。出院后均進(jìn)行隨訪,為期1a,用標(biāo)準(zhǔn)對數(shù)遠(yuǎn)視力表根據(jù)患者是否發(fā)生視力殘疾[10],分為預(yù)后不良組(40例)與預(yù)后良好組(89例)。

2 結(jié)果

2.1一般資料比較各組年齡、性別、BMI、收縮壓、舒張壓、LDL-C、TC水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較,NDR組、NPDR組、PDR組血清中HbA1c、FBG、FINS、TG水平均升高,HDL-C水平均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與NDR組比較,NPDR組病程、HbA1c、TG水平均升高,PDR組病程、FINS水平均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 一般資料比較

2.2各組血清中TLR4和VEGFA水平比較四組間TLR4、VEGFA水平比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對照組比較,NDR組、PDR組、NPDR組患者血清中TLR4、VEGFA水平均升高(P<0.05);與NDR組比較,PDR組和NPDR組患者血清中TLR4、VEGFA水平均升高(P<0.05);與NPDR組比較,PDR組患者血清中TLR4、VEGFA水平均升高(P<0.05),見表2。

表2 各組血清中TLR4和VEGFA表達(dá)水平

2.3影響DR發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析以是否發(fā)生DR為因變量,以TLR4、VEGFA、病程、HbA1c、FINS、TG為自變量,進(jìn)行Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,TLR4、VEGFA、病程、HbA1c均是DR發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05),見表3。

表3 多因素Logistic回歸分析

2.4 ROC曲線分析血清中TLR4和VEGFA預(yù)測DR發(fā)生的診斷價(jià)值以發(fā)生DR患者(NPDR組和PDR組)和未發(fā)生DR患者(NDR組)的TLR4、VEGFA數(shù)據(jù)作ROC曲線。ROC結(jié)果顯示,血清TLR4、VEGFA水平預(yù)測DR發(fā)生的AUC分別為0.869(95%CI:0.812～0.915)、0.862(95%CI:0.909～0.980),最佳截?cái)嘀捣謩e為:16.82ng/L、92.32pg/mL,對應(yīng)的敏感度分別為83.72%、82.95%,特異度分別為79.63%、88.89%,血清TLR4、VEGFA水平聯(lián)合預(yù)測的AUC為0.931(95%CI:0.884～0.963),較血清中TLR4、VEGFA單獨(dú)檢測的AUC升高,敏感度為82.17%,特異度為94.44%,見圖1。

圖1 血清TLR4及VEGFA水平預(yù)測DR發(fā)生的ROC曲線。

2.5不同預(yù)后患者血清中TLR4和VEGFA水平比較預(yù)后不良組患者血清中TLR4、VEGFA表達(dá)水平均高于預(yù)后良好組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表4。

表4 兩組血清中TLR4和VEGFA表達(dá)水平

2.6 ROC曲線分析血清中TLR4及VEGFA預(yù)測DR患者視力殘疾的預(yù)測價(jià)值ROC結(jié)果顯示,血清TLR4、VEGFA水平預(yù)測DR患者視力殘疾的AUC分別為0.864(95%CI:0.793～0.918)、0.863(95%CI:0.792～0.917),最佳截?cái)嘀捣謩e為25.21ng/L、136.84pg/mL,對應(yīng)的敏感度分別為85.00%、80.00%,特異度分別為83.15%、89.89%,血清TLR4、VEGFA水平聯(lián)合預(yù)測的AUC為0.938(95%CI:0.882～0.973),較血清中TLR4、VEGFA單獨(dú)檢測的AUC升高,敏感度為80.00%,特異度為97.75%,見圖2。

圖2 血清TLR4及VEGFA水平預(yù)測DR患者視力殘疾的ROC曲線。

3 結(jié)論

DR是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥,也是造成失明的主要原因[11-12]。在NPDR的早期,慢性高血糖會(huì)損害供應(yīng)視網(wǎng)膜的微血管,導(dǎo)致缺血、血管滲漏,以及由糖尿病黃斑水腫引起的中心視力喪失[13]。隨著疾病進(jìn)展為PDR,會(huì)出現(xiàn)與視網(wǎng)膜繼發(fā)性新生血管相關(guān)的視力喪失,以及隨后的出血、視網(wǎng)膜脫離。先前的研究表明,DR的進(jìn)展和視力喪失會(huì)損害患者的生活質(zhì)量。如果沒有適當(dāng)?shù)母深A(yù),大約一半的高危PDR患者會(huì)在診斷后5a內(nèi)因糖尿病性黃斑水腫、玻璃體出血、視網(wǎng)膜脫離而出現(xiàn)視力障礙[14]。因此,早期發(fā)現(xiàn)和治療對于延緩DR的進(jìn)展、避免視力喪失和減輕晚期疾病負(fù)擔(dān)至關(guān)重要。

本研究結(jié)果顯示,健康人群、NDR組、NPDR組、PDR組血清中HbA1c、FBG、FINS、TG、HDL-C存在顯著差異,提示血糖、血脂代謝異常在DR發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,可導(dǎo)致病情加重。

VEGF又稱血管通透性因子,是一種二聚體糖蛋白,其在脊椎動(dòng)物視網(wǎng)膜發(fā)育過程中具有促進(jìn)生長代謝級聯(lián)反應(yīng)和血管生成的作用[15]。此前,有研究報(bào)道下調(diào)VEGFA的表達(dá),可用于干預(yù)DM引起的視網(wǎng)膜微血管的炎性損傷[16]。本研究中DR患者血清中VEGFA水平顯著高于NDR患者以及健康人群,隨著DR患者預(yù)后不良的發(fā)生,VEGFA水平逐漸升高,提示VEGFA可能對DR的發(fā)生、進(jìn)展具有促進(jìn)作用,可以作為預(yù)測DR患者預(yù)后不良的潛在血清指標(biāo)。這與姜富國等[17]報(bào)道一致。推測其作用機(jī)制可能由于慢性高血糖環(huán)境可導(dǎo)致體內(nèi)蛋白質(zhì)的非酶性糖基化,導(dǎo)致基底膜增厚,甚至引起血管閉塞阻礙氧氣擴(kuò)散,引起視網(wǎng)膜缺氧,供氧減少和活性氧合成增加可誘導(dǎo)VEGFA的表達(dá),VEGFA介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接形成和血管舒張的中斷,增加血神經(jīng)屏障的通透性,從而參與DR的發(fā)展[18-19]。血脂升高通過非酶糖基化多元醇途徑引起組織過氧化,導(dǎo)致血管壁損傷和內(nèi)皮功能障礙。引起血流動(dòng)力學(xué)改變,視網(wǎng)膜組織缺氧,隨之發(fā)生微循環(huán)障礙,導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、眼底出血等一系列微血管病變,最終形成微血栓,破壞視網(wǎng)膜屏障,導(dǎo)致DR的發(fā)生[20]。ROC結(jié)果顯示,血清中VEGFA水平預(yù)測DR發(fā)生及視力殘疾的AUC分別為0.862、0.863。提示VEGFA水平可在一定程度評估DR發(fā)生及預(yù)后不良,對盡早診斷DR及改善患者預(yù)后提供重要參考依據(jù)。

TLR是一個(gè)模式識(shí)別受體家族,負(fù)責(zé)炎癥和免疫反應(yīng)的啟動(dòng),可以識(shí)別內(nèi)源性和外源性配體,并與體內(nèi)各種生理和病理途徑相關(guān)[21]。雖然DR的詳細(xì)病理生理機(jī)制尚不清楚,但越來越多的數(shù)據(jù)表明,TLR4在DR的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[22]。本研究中DR患者血清中TLR4水平高于健康人群,隨著PDR的發(fā)生水平逐漸升高,表明TLR4是DR發(fā)展過程中的一種重要細(xì)胞因子。推測其可能的潛在作用機(jī)制為高血糖會(huì)促使機(jī)體炎癥反應(yīng)程度加重,導(dǎo)致TLR4分泌增加[22],TLR4信號(hào)通路的激活導(dǎo)致下游促炎細(xì)胞因子和黏附分子增加,參與炎癥反應(yīng)[23]的發(fā)生,引起血管外滲或血管通透性增加、血管梗阻、新生血管變性和病理改變等病理改變,從而導(dǎo)致DR的發(fā)生發(fā)展[24-25]。Logistic回歸分析結(jié)果顯示,TLR4、VEGFA、病程、HbA1c均是DR發(fā)生的危險(xiǎn)因素,分析原因是HbA1c作為評估血糖控制情況的重要指標(biāo),隨著病程延長,患者血糖控制不佳,導(dǎo)致DR風(fēng)險(xiǎn)增加。此外也提示臨床表現(xiàn)為TLR4、VEGFA高表達(dá)的患者,應(yīng)及時(shí)針對制定方案治療,延緩疾病進(jìn)展;ROC結(jié)果顯示,血清TLR4水平預(yù)測DR患者視力殘疾的AUC為0.864,二者聯(lián)合預(yù)測的AUC為0.938。提示TLR4、VEGFA聯(lián)合評估DR發(fā)生及預(yù)后不良的臨床價(jià)值優(yōu)于單一指標(biāo)。

綜上所述,在DR患者血清中TLR4、VEGFA水平均顯著上調(diào),二者均為DR發(fā)生的危險(xiǎn)因素,聯(lián)合檢測TLR4、VEGFA血清水平可預(yù)測DR及預(yù)后不良的發(fā)生,具有重要的臨床意義。但目前本研究存在局限性,樣本量相對較小,還需要在更大的樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證。