韓冰, 周麗鵬, 姚文利, 徐佳婷, 董莉莉, 孫世梅*

(1.吉林建筑大學(xué)應(yīng)急科學(xué)與工程學(xué)院, 長(zhǎng)春 130118; 2.吉林建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院, 長(zhǎng)春 130118)

隨著農(nóng)業(yè)技術(shù)、醫(yī)療技術(shù)的日益進(jìn)步,以及人口數(shù)量的遞增,開發(fā)和使用了多種抗生素保障了人類的健康和生命的安全[1-2]。因每種抗生素的結(jié)構(gòu)不同、其治療作用、治愈機(jī)理差也存在著一定差別,進(jìn)入生態(tài)環(huán)境中未完全代謝的產(chǎn)物誘導(dǎo)、傳播多種類型的抗性基因,致使土著微生物的獲得多重抗生素抗性而出現(xiàn)變性,造成環(huán)境污染,危害生物的正常生命活動(dòng)和健康[3-4]。隨著污水處理技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)迅猛發(fā)展,國(guó)內(nèi)外學(xué)者開展抗生素、抗性基因的殘留、遷移、轉(zhuǎn)化等生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究[5]。金明蘭等[6]研究結(jié)果表明污水處理廠中抗生素和抗性菌的殘留量較高,存在著潛在風(fēng)險(xiǎn)。國(guó)外學(xué)者研究表明某些抗生素在動(dòng)物體內(nèi)不能被吸收的超過70%,以母體形式排到生態(tài)環(huán)境中,嚴(yán)重地威脅生態(tài)環(huán)境和人類健康[7]。如果抗性基因整合到致病菌體內(nèi),成功表達(dá)抗生素耐藥性導(dǎo)致失去治療的作用,并且嚴(yán)重地威脅人類健康[8]。研究表明,因抗生素抗性傳播,美國(guó)每年有200多萬(wàn)人致病,全球每年約有70萬(wàn)人致死[9]。由此推算,通過食物鏈途徑直接威脅人類健康,30年后全球每年將超過1 000萬(wàn)人致死[10]。因此,開展抗生素抗性菌株所攜帶的抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs),探明其對(duì)多重抗生素抗性,有效抑制ARGs的潛在威脅具有非常重要作用。

紅霉素是抗菌作用大、多組分、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定,難降解,易積聚,抑制生物生長(zhǎng)[11]。

1 材料與方法

1.1 試劑

1.2 樣品采集和培養(yǎng)基的制備

長(zhǎng)春市北郊污水處理廠位于伊通河下游,寬城區(qū)團(tuán)山街北環(huán)城路1065號(hào),采用改良型A2O(生物脫氮除磷)工藝,日處理量39萬(wàn)t。在2019年 5—10月,使用聚丙烯采集瓶無(wú)菌采集進(jìn)水、曝氣沉砂池出水、一級(jí)出水、中間沉淀池出水、二級(jí)出水和二沉池出水,各單元每次采集10 L樣品,每月處理3個(gè)/次,于4 ℃存放,盡快檢測(cè)。

1.3 抗生素含量檢測(cè)

將2 mL樣品移入試劑瓶中,在室溫條件下放置20 min,10 000 r/min離心5 min,將上清液1 mL先經(jīng)過濾、調(diào)整酸堿度后萃取、活化、干燥,分裝到專用的試劑瓶,定容密封待測(cè)。具體操作參照文獻(xiàn)[13]的方法,使用高效液相色譜儀進(jìn)行抗生素殘留量的檢測(cè)、計(jì)算。

1.4 紅霉素抗性菌的分離

首先將采集的10 mL污水移入滅菌的錐形瓶?jī)?nèi),用移液槍吸入1 mL 上清液加入含有紅霉素的燒瓶,經(jīng)25 ℃、160 r/min震蕩、培養(yǎng)7 ～ 8 d,無(wú)菌移取 0.5 mL培養(yǎng)液,接種到紅霉素濃度高出1倍培養(yǎng)基中,再培養(yǎng) 8 d。按照上述方法進(jìn)行重復(fù)操作后,依次稀釋抗生素濃度為 120 mg/L,倒立放置30 ℃恒溫箱培養(yǎng)。

1.5 紅霉素抗性菌的耐藥性檢測(cè)

按照參考文獻(xiàn)[14]的方法,采用微量液體稀釋法,在含有一定濃度的紅霉素培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,將培養(yǎng)的新鮮菌液分別投加到抗生素倍比稀釋梯度的培養(yǎng)基中,放置在37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)12～24 h后,觀察菌株生長(zhǎng)情況,分析和計(jì)算紅霉素抗性菌的耐藥性。

將紅霉素抗性菌株分離、培養(yǎng)后,開展多種抗生素的最小抑制濃度的研究,明確抗生素敏感性的臨界點(diǎn),探究分離菌株的抗生素抗性[15-16]。

1.6 抗性菌的抗性基因檢測(cè)

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 18.0 軟件,將污水中 3 種抗生素、多重抗性基因的檢測(cè)結(jié)果,通過 3 次平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,按照統(tǒng)計(jì)學(xué)中P的定義進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,判定數(shù)據(jù)間存在差異顯著或極顯著的意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 污水廠各單元中抗生素殘留檢測(cè)結(jié)果

通過6次對(duì)污水廠中紅霉素殘留濃度的檢測(cè)結(jié)果,初步認(rèn)為在5月、10月中抗生素殘留相對(duì)高于6月、7月、8月、9月,其殘留濃度為16.2～86.9、14.5～82.2 ng/L和7.5～62.2、7.7～72.3、7.9～66.9、8.4～73.9 ng/L,處理效率在81.4%～89.3%。分析其主要原因?yàn)榭股氐奶幚硇Ч艿轿鬯幚砉に?、污水?lái)源、溫度、酸堿度及其他殘留的污染物等多種因素影響,處理效率存在一定的差別[19-20]。中國(guó)學(xué)者調(diào)查分析了多年來(lái)抗生素使用量、使用種類、殘留量等,認(rèn)為每年約6萬(wàn)t抗生素位降解產(chǎn)物直接進(jìn)入生態(tài)環(huán)境中,加劇了生態(tài)環(huán)境的危險(xiǎn)性,對(duì)生物體造成的潛在危害也逐步增加[21]。結(jié)果如圖1所示。

圖1 污水處理廠各單元抗生素殘留濃度檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Concentration of antibiotics in each of the sewage

2.2 各單元中紅霉素抗性菌的檢測(cè)結(jié)果

污水中各單元?dú)埩舻募t霉素抗性菌的濃度存在一定的差別,其進(jìn)水、出水中殘留的紅霉素抗性菌的濃度分別在6.9×105～8.4×105CFU/mL和1.8×105～3.5×105CFU/mL范圍。經(jīng)過處理后抗性菌的濃度顯著在 5月、10月期間殘留的紅霉素濃度較高,分析其主要原因可能是由于這一時(shí)期抗生素生產(chǎn)量增加、匯集污水量多,微生物長(zhǎng)期暴露在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相對(duì)豐富,殘留的抗生素濃度持續(xù)增多的環(huán)境下,誘導(dǎo)微生物獲得多種抗生素抗性基因,并進(jìn)行傳播[22]。結(jié)果如圖2所示。

圖2 紅霉素抗性菌數(shù)量檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Number of EARB in the sewage

2.3 紅霉素抗性菌的耐藥性檢測(cè)結(jié)果

表1 紅霉素抗性菌多重抗性檢測(cè)結(jié)果Table 1 Multiple resistance of antibiotic-resistant bacteria

2.4 分離抗性菌株的多重抗性滴度檢測(cè)結(jié)果

圖3 抗性菌對(duì)抗生素抑制濃度分布Fig.3 Minimum inhibitory concentration of ARB

2.5 紅霉素抗性基因檢測(cè)結(jié)果

抗生素經(jīng)過多種方法處理后,遷移到生態(tài)環(huán)境中的量常處在較低的濃度,致使微生物長(zhǎng)期受到影響,獲得了多重抗性基因,出現(xiàn)對(duì)抗生素不敏感的問題[27]。微生物通過調(diào)節(jié)自身的生理、生化功能,以應(yīng)對(duì)周圍環(huán)境壓力的變化,從而減小外界對(duì)其生長(zhǎng)繁殖的不良影響,誘導(dǎo)耐藥性的發(fā)生變化。在各單元抗性基因的殘留為1.3 ～ 9.5 lg(copies/L),5～10月處理效率分別為74.7%、81.2%、79.3%、77.4%、80.8%、76.5%。污水處理系統(tǒng)對(duì)抗生素的去除效果十分顯著。在豐水期紅霉素的抗性基因的檢出率高于枯水期。面對(duì)環(huán)境中殘留的不同類型抗生素,微生物通過產(chǎn)生不同的應(yīng)對(duì)機(jī)制以提高自身的生存能力,因而進(jìn)一步誘導(dǎo)了攜帶多重抗性基因的超級(jí)微生物,潛在危害亟待徹底消除[28]。金明蘭通過污水處理廠中抗性基因檢測(cè)結(jié)果表明紅霉素基因中ermB 的絕對(duì)豐度最高,且攜帶多種抗性基因[29]。結(jié)果如表2和圖4所示。

表2 抗性基因的去除效率檢出結(jié)果Table 2 Efficiency of elimination of ARGs

2.6 紅霉素抗性菌株的基因檢測(cè)結(jié)果

表3 抗性菌未能檢出基因的分布情況Table 3 Distribution of ERB with no ARGs detected

表4 紅霉素抗性菌多重抗生素抗性基因檢測(cè)結(jié)果Table 4 Multiple antibiotic resistance genetic testing results of erythromycin resistant bacteria

3 結(jié)論

通過對(duì)北方城市污水中紅霉素濃度、抗生素抗性基因、抗性菌的檢測(cè),分析抗性菌的生物特性,闡明污水中殘留的紅霉素抗性菌產(chǎn)生多重抗性的機(jī)理,得到以下結(jié)論。

(1)目前污水處理處理技術(shù)對(duì)紅霉素去除效率需要進(jìn)一步提升,多重抗性菌對(duì)抗生素的抗性高于雙重抗性菌、單一抗性菌。

(2)在分離的紅霉素抗性菌株中,55%的菌株含有雙重、多重抗性,表明污水處理系統(tǒng)中殘留多種抗生素,微生物在長(zhǎng)期受到抗生素壓力下,獲得多重抗性,對(duì)生態(tài)環(huán)境威脅巨大,亟待需要處理。

(3)在5月和10月,紅霉素單一抗性菌、紅霉素+磺胺雙重抗性菌、三重抗性菌未檢出ARGs的菌株數(shù)量高于6月、7月、8月、9月,需要探尋抗性菌、抗性基因及抗生素抗性之間的相關(guān)性。