曹蕾, 鄒明慧, 秦雪瑩, 閆占寬, 馮靜, 高珣*, 秦昆明

(1.江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院, 連云港 222005; 2. 江蘇原創(chuàng)藥物研發(fā)有限公司, 連云港 222000; 3.遼寧省疾病預(yù)防控制中心, 沈陽 110000)

單純性肥胖是一種由于長期攝入過多熱量及消耗不充分,使得脂肪積累、脂質(zhì)代謝紊亂的慢性代謝性疾病[1-3]。肥胖伴隨有糖尿病、高血壓以及心血管和腎臟疾病的發(fā)生,為了倡導(dǎo)全球各國關(guān)注超重和肥胖人群的預(yù)防控制,世界肥胖聯(lián)盟(World Obesity Federation, WOF)2020年宣布每年3月4日為“世界肥胖日”,根據(jù)《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告(2020年)》的最新數(shù)據(jù)顯示,目前中國的成人中已經(jīng)有超過半數(shù)的人超重或肥胖,全國已經(jīng)有6 億人超重和肥胖[4]。目前,最常見的是藥物治療,如氯卡色林、利拉魯肽、奧利司他等,然而這類化學(xué)藥物常出現(xiàn)消化道不良等副作用,中藥有望在該領(lǐng)域取得一席之地。中醫(yī)對肥胖的認(rèn)識最早起源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》,認(rèn)為主要是因脾胃失調(diào)從而導(dǎo)致超重等。

依據(jù)中醫(yī)藥理論基礎(chǔ),復(fù)方降脂口服液由焦山楂、赤小豆、決明子、荷葉、茯苓、薏苡仁、玫瑰花、陳皮、枸杞子9 味中藥組成。以焦山楂為君藥,現(xiàn)代藥理研究表明焦山楂及其焦香味可促進(jìn)單純性肥胖大鼠胃動力,調(diào)節(jié)干細(xì)胞因子-受體酪氨酸激酶信號通路從而達(dá)到減肥作用[5-6];荷葉、決明子為臣藥,荷葉中的生物堿類、黃酮類以及決明子中蒽醌類、萘并吡喃酮類物質(zhì)能夠調(diào)控mTOR信號通路、抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖,介導(dǎo)脂肪代謝相關(guān)酶的表達(dá)[7-9];配赤小豆、茯苓、薏苡仁利水消腫,陳皮、玫瑰花、枸杞子理氣調(diào)中、行氣解郁、滋補(bǔ)肝腎,諸藥合用,能夠針對單純性肥胖患者達(dá)到減肥降脂的效果[10]。為探究復(fù)方降脂口服液的最佳提取工藝,現(xiàn)基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究復(fù)方中治療單純性肥胖的活性成分、作用靶點(diǎn)以及信號通路[11],并篩選活性成分與作用靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接以闡明成分-靶點(diǎn)之間具有良好活性,同時分析處方中治療肥胖癥的主要活性成分,以此為測定指標(biāo)進(jìn)行單因素及正交設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝參數(shù),為復(fù)方口服液后續(xù)生產(chǎn)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-TU-1901型紫外-可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司);MS105DU型十萬分之一電子分析天平(梅特勒托利多儀器上海有限公司,精度為0.01 mg);BSM-120.4萬分之一電子天平(上海卓精電子科技有限公司);DZTW型加熱套、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海力辰邦西儀器有限公司);DHG-9080A鼓風(fēng)干燥箱(上海博珍儀器設(shè)備制造廠)。

1.2 藥材與試劑

焦山楂(批號:20050604)、赤小豆(批號:210801)、決明子(批號:210701)、茯苓(批號:22012002-1)、陳皮(批號:21032601)以及荷葉(批號:210601)均購自連云港市北京同仁堂藥房;枸杞子(批號:220424)、薏苡仁(批號:210524)及玫瑰花(批號:200628)均購自南京海源中藥飲片有限公司;蘆丁對照品(批號:PU001-0025,純度為99.0%)購自成都普思生物科技股份有限公司);無水乙醇、硝酸鋁[Al(NO3)3]、亞硝酸鈉(NaNO2)、氫氧化鈉(NaOH)均為分析級;水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 復(fù)方降脂口服液網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1.1 復(fù)方降脂口服液的活性成分及作用靶點(diǎn)篩選

通過TCMSP(http: //tcmspw.com)檢索復(fù)方降脂口服液的活性成分,以類藥性(DL)≥0.18和口服生物利用度(OB)≥30%為條件,以及相關(guān)文獻(xiàn)總結(jié)焦山楂中的活性成分[12-14]。將活性成分在Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)轉(zhuǎn)成SMILES格式,并導(dǎo)入SwissTargetPrediction[11](http://www.swisstargetprediction.ch/)收集Probability≥0.12的作用靶點(diǎn)。最終篩選出復(fù)方中8味中藥的活性成分共有116種活性成分(去除重復(fù)),舍去未有靶點(diǎn)的活性成分,共得到390個作用靶點(diǎn),結(jié)果如表1所示。

表1 復(fù)方降脂口服液的主要活性成分Table 1 Main active components of compound lipid-lowering oral liquid

2.1.2 單純性肥胖疾病靶點(diǎn)篩選

在Genecards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中分別輸入關(guān)鍵詞“simple obesity”“obesity”“hyperlipidemia”獲得疾病靶點(diǎn),并設(shè)定Relevance score≥10篩選疾病靶點(diǎn)207 個。將活性成分的作用靶點(diǎn)與肥胖癥疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny(https://bioinfogp.cnb.csic.es/ tools/venny/)在線平臺進(jìn)行靶點(diǎn)交集,得到27 個交集靶點(diǎn)。

2.1.3 “中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將藥材中活性成分進(jìn)行ID編號,其中含有9 個重復(fù)成分,以A1、B1、B2、C1、D1、E1、E2、G1、G2表示,分別代表的是槲皮素、豆甾醇、CLR、谷甾醇、環(huán)阿屯醇、α1-谷甾醇、亞油酸乙酯、β-谷甾醇、花青苷。將“中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)文件和屬性文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖,如圖1所示。結(jié)果數(shù)據(jù)分析得出,該網(wǎng)絡(luò)共有490個節(jié)點(diǎn),共有1 665條邊,其中Degree≥20的活性成分有24 種,分別來自焦山楂、荷葉、茯苓、玫瑰花、枸杞子這5味藥材,其中作用較強(qiáng)的化合物是槲皮素、維生素-E、山柰酚、異鼠李素等;Degree≥20的作用靶點(diǎn)有9 個,分別是CYP19A1、AR、PTPN1、ESR2、SHBG、ESR1、NR1H3、HMGCR、RORC。

綠色三角形表示中藥名稱,藍(lán)色菱形表示作用靶點(diǎn),所有圓形表示中藥活性成分;JSZ為焦山楂;CXD為赤小豆;JMZ為決明子;HY為荷葉;FL為茯苓;YYR為薏苡仁;MGH為玫瑰花;CP為陳皮;GQZ為枸杞子圖1 “中藥-有效成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 “Medicinal material-component-target” network diagram

2.1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將27個交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(https: //string-db.org/)數(shù)據(jù)庫分析,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)如圖2所示。節(jié)點(diǎn)所顯示的形狀越大、顏色越深,說明該靶點(diǎn)的度(degree)就越高;邊的粗細(xì)反映連接評分(combined score)大小變化,邊越粗combined score越大。由可視化結(jié)果分析可知,得到27個節(jié)點(diǎn)和138條邊,平均節(jié)點(diǎn)值為10.2,其中AKT1、IL6、PPARG、TNF是在PPI網(wǎng)絡(luò)中有較高程度的節(jié)點(diǎn),可能是肥胖癥的核心候選靶點(diǎn)。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network diagram

2.1.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析,且采用微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn)繪制富集圖。GO富集得到所有功能條目563 條,包括522 條生物過程條目(biological process,BP),31條分子功能條目(molecular function,MF)以及10 條細(xì)胞組成條目(cellular composition,CC)。其中生物過程主要包括防御反應(yīng)的調(diào)節(jié)(regulation of defense response)、蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of protein phosphorylation)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)(regulation of inflammatory response)、蛋白質(zhì)激酶活性的調(diào)節(jié)(regulation of protein kinase activity)等,分子功能主要包括核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、核類固醇受體活性、脂質(zhì)結(jié)合、類固醇結(jié)合等,細(xì)胞組分主要包括受體復(fù)合體、質(zhì)膜外側(cè)、神經(jīng)元細(xì)胞體等,如圖3所示。

圖3 GO功能富集分析網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of GO functional enrichment analysis

KEGG通路富集得到87 條信號通路,以富集程度(enrichment)、顯著性(lgP)值高于均值為標(biāo)準(zhǔn),篩選出前10 條信號通路進(jìn)行可視化分析,主要包括胰島素抵抗、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、脂肪分解調(diào)節(jié)、TNF信號通路、AMPK信號通路[15-18]等,如圖4所示。

圖4 KEGG通路分析圖Fig.4 KEGG pathway analysis diagram

2.1.6 “活性成分-作用靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

為進(jìn)一步探究中藥活性成分、作用靶點(diǎn)與信號通路之間的相互聯(lián)系,從KEGG通路富集分析數(shù)據(jù)中進(jìn)行篩選,將各信號通路導(dǎo)入KEGG(https://www.kegg.jp/)中查詢信號通路與肥胖癥的聯(lián)系,獲得20 條與肥胖密切相關(guān)的關(guān)鍵信號通路,構(gòu)建“活性成分-作用靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行拓?fù)浞治? 如圖5所示。結(jié)果分析顯示,3β-羥基-羊毛甾-24-亞甲基-21-酸、槲皮素、山柰酚、異鼠李素為核心成分。

菱形表示作用靶點(diǎn);長方形表示信號通路;圓形表示復(fù)方活性成分圖5 有效成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-主要通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Components-key targets-main pathway network diagram

2.1.7 分子對接驗(yàn)證

以PPI網(wǎng)絡(luò)圖中Degree值高低進(jìn)行排序,選擇前3 個關(guān)鍵靶點(diǎn)(AKT1、IL6、PPARG)分別與“中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)中3 個關(guān)鍵成分(4-羥基肉桂酸、異鼠李素、山柰酚)進(jìn)行分子對接,從表2中分析發(fā)現(xiàn)與3 個核心靶點(diǎn)對接最低結(jié)合能的活性成分為異鼠李素,能與AKT1、IL6、PPARG可以較好結(jié)合,如圖6所示,分別是異鼠李素與AKT1、IL6、PPARG分子對接的2D、3D圖。

圖6 異鼠李素與AKT1、IL6、PPARG受體-配體相互作用2D、3D圖Fig.6 2D and 3D images of the interaction of isorhamnetin with AKT1, IL6 and PPARG receptor-ligand

表2 關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接的分子結(jié)合力Table 2 Molecular binding force of key active ingredients for docking with core target molecules

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 溶液的配制

取蘆丁對照品約10 mg,精密稱定,置于25 mL容量瓶中,加入60%乙醇溶解稀釋定容至刻度,搖勻,即得蘆丁對照品溶液(400 μg/mL)。按處方稱取藥材125 g,加入1 500 mL量水,浸泡60 min后煎煮45 min,后下荷葉、玫瑰花、陳皮,共煎25 min,過濾濃縮至約200 mL,加水定容至250 mL。精密移取1 mL濃縮液,置于10 mL容量瓶中,加60%乙醇混合均勻,并定容至刻度,搖勻后過0.45 μm濾膜,即得供試品溶液。

2.2.2 檢測波長的選擇

精密移取適量2.2.1節(jié)下對照品溶液和供試品溶液,分別加入5% NaNO20.3 mL,搖勻放置6 min,再加入10% Al(NO3)30.3 mL,搖勻放置6 min,最后加入4% NaOH 4.0 mL,60%乙醇定容至10 mL,搖勻放置10 min[19]。以60%乙醇溶液作為空白,在400～900 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描。結(jié)果測得蘆丁對照品溶液最大吸收在509 nm處。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系:精密移取對照品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL,置于不同10 mL具塞比色管內(nèi),按照2.2.2節(jié)方法操作測定線性溶液的吸光度。以吸光度(Abs)作為縱坐標(biāo),溶液濃度C作為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性繪圖,得到線性方程為A=0.011 6C-0.002 1(r2=0.999 7,n=5),表明蘆丁對照品溶液在0～96 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):分別精密移取蘆丁對照品溶液1.2 mL、供試品溶液1 mL,置于不同的10 mL具塞比色管中,連續(xù)測定6次,RSD分別為0.07%、0.26%,表明該方法儀器精密度、重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密移取蘆丁對照品溶液1.2 mL,在室溫下分別靜置0、10、20、30、40、50、60 min后進(jìn)行測定。結(jié)果表明在室溫下顯色后60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為0.83%,因此檢測應(yīng)在顯色后60 min內(nèi)進(jìn)行測定。

加樣回收率試驗(yàn):精密移取已知總黃酮含量的供試品溶液0.5 mL和蘆丁對照品溶液(400 μg/mL)0.6 mL置于10 mL比色管中,平行制備6份,測定吸光度并計(jì)算總黃酮含量(total flavonoid content,TFC)。結(jié)果得平均加樣回收率為104.89%,表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.3 干膏得率的測定

精密移取10 mL水提濃縮液置于蒸發(fā)皿(已干燥至恒重)中,水浴蒸干,置于105 ℃烘箱中干燥3 h后,于干燥器冷卻30 min,迅速稱定質(zhì)量,再于105 ℃干燥1 h,冷卻稱定質(zhì)量,反復(fù)干燥至恒定質(zhì)量,計(jì)算干膏率。

2.4 復(fù)方降脂口服液提取工藝優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

以不同的加水量A(500、750、1 000、1 250、1 500 mL)、浸泡時間B(20、30、40、60、70 min)、先煎時間C(30、45、60、75、90 min)、后下共煎時間D(5、15、25、35、45 min)為考察因素,進(jìn)行加熱回流提取,以總黃酮含量和干膏得率為評價(jià)指標(biāo),確定各因素三水平[20],如表3所示。

表3 提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Levels and factors of the orthogonal of water extraction

2.4.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),以總黃酮含和干膏率為綜合評價(jià)指標(biāo)(C),優(yōu)化復(fù)方降脂口服液的提取工藝參數(shù)。

(1)

式(1)中:TFCi為測得總黃酮含量;TFCmax為測得最大總黃酮含量;Gi為測得干膏率;Gmax為測得最大干膏率。

如表4所示,直觀分析各因素對復(fù)方降脂口服液的提取工藝的影響依次為A>B>D>C。如表5所示,加水量對提取效果的影響具有顯著性(P<0.05)。最佳提取條件為A3B3C1D2,即加水量為1 500 mL、浸泡時間為60 min、先煎時間為45 min、后下共煎時間為25 min。

表4 正交實(shí)驗(yàn)直觀分析表Table 4 Results of orthogonal test

表5 水提工藝試驗(yàn)方差分析表Table 5 Analysis of variance of water extraction

2.4.3 工藝驗(yàn)證

對優(yōu)選的最佳工藝參數(shù)A3B3C1D2,進(jìn)行工藝驗(yàn)證,平行制備3份樣品,測定總黃酮含量及干膏率,如表6所示。在最佳提取工藝條件下,總黃酮含量和干膏率的RSD分別為1.26%和0.59%。

表6 工藝驗(yàn)證結(jié)果Table 6 Results of process validation

3 討論與結(jié)論

肥胖是一種由遺傳、環(huán)境等多因素而引起能量代謝紊亂的慢性炎癥,中醫(yī)認(rèn)為該癥與脾胃功能失調(diào)有關(guān)。復(fù)方降脂口服液依據(jù)中醫(yī)藥理論組成,能夠綜合調(diào)節(jié)機(jī)體以實(shí)現(xiàn)減肥降脂的功效,但藥理作用機(jī)制尚不明確。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,構(gòu)建了“中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”和“活性成分-作用靶點(diǎn)-信號通路”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖,篩選得到116種活性成分,其中大多數(shù)化合物歸屬于焦山楂、荷葉、決明子、茯苓、枸杞子這5味藥材,與中醫(yī)藥治療肥胖組方的用藥頻次一致[21-22];活性成分的作用靶點(diǎn)與單純性肥胖疾病靶點(diǎn)映射得到24個交集靶點(diǎn),PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)AKT1、IL6、PPARG、TNF是治療肥胖癥的關(guān)鍵靶點(diǎn),且GO功能富集及KEGG通路富集分析得出本品治療單純性肥胖,主要作用于AKT1、IL6、PPARs、TNF、VEGFA等靶點(diǎn),調(diào)控胰島素抵抗、AGE-RAGE信號通路、脂肪分解、AMPK、PI3K-Akt等信號通路,也有研究表明通過刺激腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL6、IL20)等的釋放激活胰島素抵抗、炎癥反應(yīng),從而緩解代謝綜合征[23];分子對接結(jié)果表明:異鼠李素、山柰酚與PPARG的結(jié)合力較好,且異李鼠素對AKT1、IL6、PPARG的結(jié)合能力均強(qiáng)于4-羥基肉桂酸、山柰酚;由此可見,該口服液通過多成分-多靶點(diǎn)-多通路-多生物途徑,實(shí)現(xiàn)治療單純性肥胖[24-26]。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)對復(fù)方降脂口服液治療單純性肥胖的作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測,并篩選出其治療肥胖的活性成分如黃酮類、有機(jī)酸類、甾醇類化合物,其中絕大多數(shù)物質(zhì)為黃酮類化合物?；诖?以總黃酮含量及干膏得率作為評價(jià)指標(biāo),采用先煎后下的提取方式考察加水量、浸泡時間、先煎時間、后下共煎時間對提取工藝的影響,確定最佳提取工藝條件為加水量1 500 mL、浸泡60 min后煎煮45 min,后下荷葉、陳皮、玫瑰花共煎25 min,并工藝驗(yàn)證該提取條件穩(wěn)定可靠,可為后續(xù)進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。