阮彥楠，付利波，番華彩，陳檢鋒，鄭泗軍，尹 梅，王 偉，陳 華，王永芬,3，毛 俊，李 舒*，王志遠*

（1 云南省農業(yè)科學院農業(yè)環(huán)境資源研究所，云南昆明 650205；2 昆明學院，云南昆明 650214；3 云南省農業(yè)科學院熱帶亞熱帶經濟作物研究所，云南保山 678000）

光葉苕子 (Viciavillosavar.) 是近年南方發(fā)現的一種具有能夠改善土壤肥力、減少化肥施用量和提高作物抗性的一年生豆科植物，在保障作物高產和構建良好農業(yè)生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮著不可替代的作用[1]。有研究表明光葉苕子含有部分具有抗病、促生以及抗重金屬等多種功能內生菌，種植光葉苕子可以增加土壤中微生物的豐度，提高作物產量和抗性[2]。

香蕉是世界上第一大水果，是重要的經濟糧食作物，但是由尖孢鐮刀菌古巴?；? 號生理小種(Fusariumoxysporumf.sp.cubenseTropical Race 4，FOC TR4) 引起的香蕉枯萎病給香蕉產業(yè)帶來毀滅性破壞。TR4 作為一種真菌性土傳病害，其孢子在土壤中可存在數十年之久，且到目前為止尚無行之有效的防治措施[3]。病原菌絲可通過莖葉維管束侵染香蕉植株，導致疏導組織堵塞，營養(yǎng)和水分供應受阻，葉片黃化，嚴重時整株死亡[4]。為了應對香蕉枯萎病病害肆虐，多使用化學防治和生物防治等方法保護香蕉。雖然化學防治在一定條件下能快速控制病害，但長期使用化學農藥不僅會使病原菌產生抗藥性，還會破壞土壤微生物活性，致使生態(tài)環(huán)境失衡。隨著農業(yè)可持續(xù)發(fā)展觀念的強化，生物防治中有益微生物的應用是目前認為的一種最有潛力防治植物病原真菌的方法，具有安全、綠色、高效等優(yōu)點，近年來，篩選更多效果好、易培養(yǎng)的生防菌的研究已經逐漸成為香蕉枯萎病防治的熱點[5]。

有研究發(fā)現，香蕉套作綠肥白三葉草能顯著降低香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌的總體數量，進而減少香蕉枯萎病的發(fā)病風險[6]；李朝生等[7]發(fā)現，香蕉套種黑皮冬瓜后通過提高土壤pH，降低土壤電導率，提高土壤堿解氮含量，改變土壤細菌群落結構達到降低香蕉枯萎病發(fā)病率的目的；也有研究表明，香蕉采用套作模式種植部分豆科綠肥和施用生物有機肥時，均有抑制香蕉枯萎病的效果[8]。以上研究發(fā)現，當豆科綠肥與香蕉套作時，可能潛藏著獨特的微生物種群結構，降低香蕉枯萎病的發(fā)病率。其中還存在一些具有顯著鐵載體產生潛力的細菌，可通過與植物病原菌競爭鐵離子來抑制其菌絲生長和孢子萌發(fā)，同時分泌吩嗪、表面活性劑和番紅菌素等抗生素活性物質[9]，從而抑制病原菌生長；Yu 等[10]發(fā)現了一株拮抗尖孢鐮刀菌的假單胞菌BAF.1，其通過產生鐵載體來抑制尖孢鐮刀菌，抑制率達95.24%。邱美莎等[11]研究發(fā)現深色有隔內生真菌X22 既能促生，又能顯著抑制香蕉枯萎??；卯婷婷等[12]從獼猴桃根際土壤中分離出一株高效解磷真菌MHT0308 菌株，且對獼猴桃軟腐病菌的抑菌率達87.71%；陳陽[13]從水稻中分離出一株內生固氮菌BV6，具有溶磷、產鐵載體和拮抗灰霉、稻瘟病菌、指狀青霉、尖孢鐮刀菌等植物病原真菌的能力；劉彩霞等[14]在森林土壤中分離到兩株具有溶解無機磷、有機磷及解鉀能力的菌株1020 和2001，且分別對擬盤多毛孢和膠孢炭疽菌具有較好的抑制作用。所以在自然界中廣泛存在著具有多元功能的微生物，既能通過分泌鐵載體、解磷、解鉀、固氮和產生長素來促進植物生長，又能夠對植物病原菌產生抑制作用。

以上研究表明，豆科綠肥具有豐富的內生菌且部分內生菌在提高作物抗性和促生方面具有很大的應用潛力，但光葉苕子作為綠肥其內生菌的相關研究還鮮見報道，從中篩選出更多促生防病效果好、易培養(yǎng)的內生菌也是目前研究的一個熱點之一。所以本研究以光葉苕子根為研究材料，利用平板對峙法篩選對香蕉枯萎病菌具有拮抗作用且可分泌鐵載體、解磷、解鉀和固氮的菌株，然后對拮抗促生菌株進行分類鑒定、抑菌測定及香蕉枯萎病盆栽防效試驗，從而確定菌株的分類地位及對香蕉枯萎病的生防效果，旨在為光葉苕子綠色化有機菌肥的種植推廣和微生物菌肥的研究開發(fā)奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試光葉苕子根部樣品于2021 年11 月取樣，采用五點取樣法在云南省昆明市嵩明縣綠肥長期定位試驗基地 (102°41′E，25°28′N)進行。香蕉品種為巴西蕉，由云南省農業(yè)科學院農業(yè)生物多樣性研究室進行組培擴繁。供試香蕉病原菌為尖孢鐮刀菌古巴?；? 號生理小種 (FusariumOxysporumf.sp.CubenseTropical Race 4，FOC TR4) 菌株15-1，由云南農業(yè)科學院農業(yè)環(huán)境與資源研究所香蕉研究團隊，從西雙版納種植田中的巴西香蕉品種分離、鑒定和保存的具有較高毒性和致病性的菌株[15]。

PCR 反應所需的試劑購自北京擎科生物科技有限公司。LB 固體培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)、無機解磷培養(yǎng)基、解鉀培養(yǎng)基和Ashby 無氮培養(yǎng)基配方均參照鞏文峰等[16]的文獻，鉻天青 (chrome azurol S，CAS) 雙層顯色培養(yǎng)基配方參照申云鑫等[9]的文獻。

1.2 拮抗病原菌內生菌的分離與篩選及對TR4 的影響

1.2.1 拮抗病原菌內生菌的分離與篩選 內生菌的分離首先采集光葉苕子非菌根亞根 (直徑7～8 mm)，將其表面清洗干凈，無菌操作臺中稱取l0 g 洗凈的植物根系，先用75% 的乙醇進行表面消毒，再用0.1%升汞浸泡30 s～1 min，每次消毒完用無菌水沖洗3 次，放入裝有9 mL 無菌水的滅菌研缽中，加入少許滅菌的石英砂充分研磨，靜置15 min 后取1 mL 稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6濃度梯度，涂布于LB 固體培養(yǎng)基，將最后一次沖洗光葉苕子組織的無菌水設做空白對照。根據菌落形態(tài)，挑選平板上長勢較好、生長速度較快的單菌落，劃線分離，純化菌株，-80℃甘油保存。

拮抗菌的篩選采用平板對峙法[17]，初篩使用無菌打孔器打取直徑2 mm 的TR4 菌餅接種在PDA 培養(yǎng)基中央，在相隔菌餅2.5 cm 處接種篩選得到的內生菌菌株置于同一平板上，用密封條封好，以沒有接種待篩選拮抗菌株的平板作為對照，重復3 次，置于培養(yǎng)箱，28℃條件培養(yǎng)72 h，初步篩選具有抑菌效果的內生菌株。

1.2.2 拮抗菌對TR4 的影響及抑菌活性測定 為了進一步驗證對TR4 具有拮抗活性的內生菌，拮抗菌的復篩參考Li 等[18]的平板對峙法進行(圖1A)，采用十字劃線法將香蕉枯萎病TR4 菌餅接種在新制備的PDA 培養(yǎng)基平板中央，用接種環(huán)挑取具有抑菌效果的內生菌株接種在距TR4 菌餅2.5 cm 處，以不接種拮抗菌為對照，28℃下培養(yǎng)7 天，3 次重復，評估抑制效率的結果。采用雜交法測定TR4 菌落的直徑，計算平均抑菌效果。

圖1 雙培養(yǎng)試驗接種位置及取樣位置示意圖Fig.1 Diagram of inoculation position and sampling position in double culture test

抑制率 (%)=[(對照組病原菌生長直徑-處理組病原菌生長直徑)/(對照組病原菌生長直徑-接種菌餅直徑)]×100。

1.2.3 拮抗菌發(fā)酵液對TR4 的影響 發(fā)酵液原液制備：挑取純化的菌株Sz-2 單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min 震蕩培養(yǎng)3 天，得到發(fā)酵液原液。發(fā)酵液上清液提取：將500 mL 發(fā)酵液原液分裝于50 mL 離心管中，常溫下12000 r/min 離心30 min，棄沉淀保留上清液，用0.22 μm 孔徑的濾膜除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

發(fā)酵液處理液抑菌活性測定：以無菌水為對照，采用牛津杯打孔抑菌試驗測定發(fā)酵液上清液的抑菌活性。在PDA 平板中心距邊緣25 mm 處用孔徑7 mm 的牛津杯進行打孔，每孔加入100 μL 發(fā)酵液處理液，每個處理重復3 次，平板中心位置加入病原真菌。28℃培養(yǎng)7 天后測定發(fā)酵液處理液的抑菌率。

1.3 拮抗菌株對TR4 菌絲生長及形態(tài)的影響

TR4 病原菌與拮抗菌在28℃雙培養(yǎng)7 天后，挑取對峙平板與空白對照的TR4 菌絲于潔凈載玻片上制片 (圖1B)，利用掃描電子顯微鏡觀察拮抗菌對TR4 菌絲結構的影響。

1.4 根系拮抗內生菌溶磷、解鉀、固氮和產鐵載體能力測定

配置無機磷培養(yǎng)基、解鉀培養(yǎng)基、Ashby 無氮培養(yǎng)基和CAS 檢測培養(yǎng)基，在4 種功能培養(yǎng)基上接種以LB 培養(yǎng)的內生拮抗菌菌株，3 個重復；在37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)7 天后，其中溶磷功能通過有無透明圈來確定，解鉀和固氮功能通過觀察是否在培養(yǎng)基上生長來確定，產鐵載體功能通過觀察菌落周圍產生橘黃色暈圈來確定菌株能夠分泌鐵載體，且黃色圈的直徑大小與該菌株分泌鐵載體能力大小成正比，通過以上方法初步判斷菌株的溶磷、解鉀、固氮和產鐵載體能力[9,16]。

1.5 促生拮抗菌株的鑒定

1.5.1 菌株形態(tài)學觀察 將菌株在LB 培養(yǎng)基上30℃劃線培養(yǎng)24 h，觀察并記錄菌落形態(tài)、透明度、顏色等特征，利用掃描電子顯微鏡 (蔡司Sigma 300，柏林，德國)觀察菌株的顯微形態(tài)。

1.5.2 促生拮抗菌株的分子鑒定 細菌的16S rDNA 序列在不同的物種間是高度保守的，不同的物種間序列是不一樣的，因而對此序列通過PCR擴增、測序，與GenBank 中的已知序列進行比對后，則可判定細菌種類，將其劃分到屬。將促生拮抗菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基中，在37℃、220 r/min的條件下培養(yǎng)24 h。取1 mL 菌液12000 r/min 離心1 min 收集菌體，使用TSINGKE 植物DNA 提取試劑盒 (通用型) 提取菌體DNA。采用通用引物 (委托北京擎科生物科技有限公司合成) 27F/1492R：(5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'、5'-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3')對該菌株的16S rDNA 進行擴增，提取的DNA 樣品適量稀釋后作為PCR 模板，以擎科1×TSE101 金牌mix 進行擴增，擴增體系(50 μL) 各組分如下：1×TSE101 金牌 mix 45 μL，上游引物27F 2 μL，下游引物1419R 2 μL，DNA 模板1 μL。以上擴增體系按以下擴增程序擴增：98℃預變性2 min，其次循環(huán)階段是在98℃下變性10 s，56℃退火10 s，72℃下延伸5 s，共有35 個循環(huán)，72℃進行溫浴5 min，4℃環(huán)境下保存?zhèn)溆?。將擴增好的PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳 (2 μL 樣品+6 μL 溴酚藍)，300 V 電壓下12 min，獲取鑒定膠圖。將準備好PCR 產物送至北京擎科生物科技有限公司測序部進行一代測序。隨后進行系統(tǒng)發(fā)育分析，將測序結果在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)序列同源性比對，后于GenBank 數據庫進行比較分析，選取同源性較高的模式菌株序列作為參比對象，采用MEGA 7.0 鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設定為1000，其余均為默認值。

1.5.3 菌株的生理生化性質測定 細菌的生理生化測定參照《伯杰細菌鑒定手冊》[19]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[20]進行。

1.6 拮抗菌株Sz-2 對香蕉枯萎病盆栽防效及對香蕉植株的促生作用測定

1.6.1 盆栽前處理 溫室盆栽試驗于2022 年8 月至11 月進行。將巴西蕉組培苗轉入砂基質中進行馴化30 天。選擇5～6 片葉的香蕉植株進行盆栽試驗，評價TR4 的生物防治和促生長效果。

1.6.2 拮抗菌株發(fā)酵原液制備 使用無菌接種環(huán)挑取促生拮抗單菌落接種到LB 液體培養(yǎng)基中，在37℃和220 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)48 h 后，得到發(fā)酵液。用無菌水將懸浮液稀釋至OD600=1.0，調節(jié)發(fā)酵液中菌株濃度為1×108cfu/mL。

1.6.3 TR4 尖孢鐮刀菌孢子液發(fā)酵液制備 在新制備的PDA 培養(yǎng)基上活化TR4 菌株15-1，28℃培養(yǎng)7 天后，刮取活化的病原菌菌絲置于PDB 液體培養(yǎng)基中，在28℃和180 r/min 下振蕩培養(yǎng)72 h。然后，用四層無菌紗布過濾菌絲，得到TR4 孢子懸液。用無菌水稀釋至1×106cfu/mL 的TR4 孢子溶液，4℃下儲存待用。

1.6.4 盆栽試驗設計 選擇具5～6 葉片的香蕉植株進行盆栽試驗，每盆香蕉苗灌根前進行傷根處理。陽性對照組1 (TR4)：用濃度為1×106cfu/mL TR4 孢子發(fā)酵液懸液進行灌根處理 (50 mL)；陰性對照組2 (CK)：PDB 液體培養(yǎng)基進行灌根處理 (50 mL)；處理組1 (TR4+拮抗菌) 進行灌根處理：用濃度為1×106cfu/mL TR4 孢子發(fā)酵液懸液 (50 mL)+濃度為1×108cfu/mL 拮抗菌株發(fā)酵液進行灌根處理 (50 mL)；處理組2 (拮抗菌)：濃度為1×108cfu/mL 拮抗菌株發(fā)酵液進行灌根處理 (50 mL)。培養(yǎng)7 天后再次向處理組1 和處理2 灌根等量的拮抗菌發(fā)酵原液。所有處理3 次重復。

1.6.5 TR4 生物防治效果及對香蕉促生效果的評價 接種45 天后，分別觀察記錄香蕉葉片和球莖的發(fā)病情況，參考Fan 等[17]的方法計算各組病情指數和防效。葉片病害分級標準：0 級，無癥狀；1 級，真葉和子葉黃萎面積不超過總面積的50%；2 級，真葉和子葉黃萎面積超過總面積的50%；3 級，葉片枯萎或死亡，只有生長點存活；4 級，整株植物嚴重枯萎或死亡；球莖病害分級：0 級，球莖無病變；1 級，球莖病變面積為1%～10%；2 級，球莖病變面積為11%～30%；3 級，球莖病變面積為31%～50%；4級，球莖病變面積大于50%。接種第45 天時，測量并記錄每個處理香蕉的株高、鮮重、莖粗和葉片數。

發(fā)病指數=∑(各級病株數×相對級數值)/(調查總株數×最高病級數值)×100

防治效果(%)=(CK 病情指數-處理病情指數)/CK病情指數×100

2 結果與分析

2.1 拮抗內生菌的分離與篩選

共篩選得到內生菌140 株，其中經雙重培養(yǎng)初篩，獲得4 株拮抗內生菌，經雙培養(yǎng)的二次篩選后，獲得一株拮抗效果較好的內生拮抗菌株(表1，圖2)，其中Sz-2 的抑菌效果最強，香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌菌落平均直徑為1.95 cm，徑向生長平均抑制率達74.30%，發(fā)酵液對TR4 的徑向生長平均抑制率達31.21%，故將Sz-2 作為后續(xù)研究目標菌株。

表1 4 株拮抗菌對香蕉枯萎病TR4 的抑菌效果Table 1 The antibacterial effect of four antagonistic bacteria on banana Fusarium wilt TR4

圖2 Sz-2 對香蕉枯萎病TR4 的拮抗效果Fig.2 Antagonistic effect of Sz-2 on banana Fusarium wilt TR4

2.2 拮抗菌株對TR4 菌絲生長及形態(tài)的影響

拮抗菌Sz-2 與TR4 經平板對峙雙培養(yǎng)7 天后，拮抗菌株抑制TR4 菌絲生長并導致菌絲畸形，交聯變形，且孢子數聚集增多。單獨培養(yǎng)TR4 對照 (CK)的菌絲正常、光滑、均勻，孢子形態(tài)完整，數目正常 (圖3 A、B)。與單培養(yǎng)TR4 菌絲形態(tài)相比，Sz-2誘導TR4 菌絲明顯腫脹，節(jié)間縮短，分枝增多，菌絲粗糙 (圖3 C、D，箭頭1)。菌絲尖端擴張，呈泡狀 (圖3 C，箭頭2)，菌絲在中間擴張或變細 (圖3 C、D，箭頭3)。衣原體孢子形成，數目增多 (圖3 D，箭頭4)。

圖3 菌株Sz-2 對TR4 的拮抗作用掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscope images of the antagonistic effect of strain Sz-2 on TR4

2.3 拮抗菌Sz-2 溶磷、解鉀、固氮和產鐵載體能力測定

溶磷、解鉀、固氮和產鐵載體能力驗證結果發(fā)現，拮抗菌Sz-2 具有溶解無機磷、解鉀和產鐵載體能力 (表2，圖4)；其中拮抗菌Sz-2 溶磷圈直徑大小為3.3±0.1 cm，菌落大小2.4±0.53 cm，溶磷圈直徑與菌落直徑大小比為1.41±0.26；拮抗菌Sz-2 產鐵載體橙黃圈直徑大小為3.53±0.15 cm，菌落大小0.57±0.06 cm，橙黃圈直徑與菌落直徑大小比為6.28±0.67。通過分析發(fā)現拮抗菌Sz-2 的產鐵載體能力比溶解無機磷能力強，且能在解鉀培養(yǎng)基上生長產生粘稠狀物質，證明具有解鉀能力；在Ashby 無氮培養(yǎng)基不生長，不具有固氮的潛力。

表2 拮抗菌Sz-2 溶磷、解鉀、固氮和產鐵載體能力Table 2 The ability of Sz-2 to dissolve phosphorus, potassium hydrolysis, nitrogen fixation and siderophore production

圖4 拮抗菌Sz-2 的溶磷、產鐵載體、解鉀和固氮能力Fig.4 Phosphate-solubilizing, siderophore-producing, potassium-dissolving and nitrogen-fixing capacities of antagonistic bacterium Sz-2

2.4 拮抗菌Sz-2 菌株的形態(tài)學特征

拮抗菌株Sz-2 在30℃下LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 天的形態(tài)特征菌落呈淺白色，表面不透明且粗糙，部分菌落中間凸起產生物膜，邊緣不規(guī)則呈放射狀(圖5)；其背面的顏色略比正面深，呈黃白色。在無機磷培養(yǎng)基上菌落呈放射狀，邊緣不規(guī)則，菌落大小2.4±0.53 cm (圖4A)；在CAS 培養(yǎng)基上生長不良，呈團狀，聚集，菌落大小0.57±0.06 cm (圖4B)；在解鉀培養(yǎng)基上菌落呈淡黃色，有粘液狀物質形成，菌落大小約2.3±0.06 cm (圖4C)。電鏡掃描 (SEM)結果顯示，細菌兩端平滑，呈短桿狀或腎狀，細菌長度大小為1.2～1.75 μm，寬度大小為0.82～0.95 μm(圖5)。

圖5 拮抗菌株Sz-2 的形態(tài)Fig.5 Morphology of antagonistic strain Sz-2

2.5 拮抗細菌SZ-2 的分子鑒定

以菌株Sz-2 基因組為模板，經16S rDNA PCR擴增，其產物測序后得到1378 bp 的基因片段。將測序所得結果提交至NCBI 數據庫進行Blast 序列比對，選取14 株與Sz-2 同源性較高的菌株和模式菌株序列通過MEGA 7.0 構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，構建菌株系統(tǒng)進化樹 (圖6)。生理生化測定結果 (表3) 顯示，菌株Sz-2 為革蘭氏陰性細菌，接觸酶、氧化酶、賴氨酸脫羧酶、β-半乳糖苷酶、精氨酸雙水解酶、明膠水解、硝酸還原反應、纖維二糖、檸檬酸反應、葡萄糖發(fā)酵反應、酪素水解等均為陽性，吲哚反應、淀粉水解、產H2S 反應、鳥氨酸脫羧酶、脲酶反應為陰性。結合菌株形態(tài)學特征以及細菌生理生化指標測定結果，將菌株Sz-2 鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。

表3 拮抗菌Sz-2 的生理生化測定Table 3 Physiological and biochemical determination of antagonistic bacterium Sz-2

圖6 基于16S rDNA 序列構建的菌株Sz-2 系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain Sz-2 constructed based on 16S rDNA sequence

2.6 菌株Sz-2 對香蕉枯萎病盆栽防效及對香蕉植株的促生效果

2.6.1 菌株Sz-2 對香蕉枯萎病盆栽防效 接種45 天后，僅接種TR4 的對照組 (CK+TR4，圖7A) 葉片變黃，植株發(fā)育不良，下部葉枯死脫落，且部分香蕉苗整株枯死，發(fā)病程度較高；而處理組1 (尖孢鐮刀菌孢子發(fā)酵液懸液+拮抗菌Sz-2 發(fā)酵溶液) 的大部分葉片保持健康 (圖7C)，植株生長良好，偶有發(fā)病，但發(fā)病程度較低，說明拮抗菌Sz-2 對TR4 的侵染起到了一定的抑制作用，這與Fan 等[17]和Li 等[18]的研究結果相似，而處理組2 (拮抗菌Sz-2 發(fā)酵溶液) 和陰性對照組2 (LB 液體培養(yǎng)基) 無發(fā)病情況。此外，在球莖分裂生長后，Sz-2 處理組1 的球莖幾乎沒有被TR4 菌絲侵染 (圖7C)，而僅接種TR4 的對照組香蕉苗球莖縱剖面褐變明顯，球莖的顏色為棕褐色或棕黑色 (圖7A)，拮抗菌Sz-2 抑制了TR4 侵染植株球莖。綜上所述，拮抗菌Sz-2 可以顯著抑制病原菌對香蕉葉片和球莖的侵染，降低香蕉枯萎病的發(fā)病情況。

圖7 拮抗菌株Sz-2 的生防效果及促生作用效果Fig.7 Biological control effect and growth-promoting effect of antagonistic strain Sz-2

通過盆栽試驗調查表明，拮抗菌Sz-2 對TR4 病原菌有顯著的抑制作用。其中Sz-2 處理香蕉球莖和葉片的病情指數均顯著低于對照組 (CK+TR4)，而且對香蕉球莖和葉片的防治效果可達69.66%±8.58%和84.60%±5.17% (表4)。

表4 菌株Sz-2 對TR4 的生物防治效果Table 4 Biological control effect of strain Sz-2 on TR4

2.6.2 拮抗菌Sz-2 對香蕉的促生長作用 接種生物菌株Sz-2 對香蕉植株的生長有明顯的促進作用(表5)?；谵卓咕鶶z-2 香蕉盆栽試驗的分析，結果顯示，與空白對照組CK 相比，只接種Sz-2 對香蕉葉片數無顯著影響，而對香蕉的莖粗、鮮重和株高有顯著的影響，香蕉的莖粗、鮮重和株高分別提高了6.01 mm、83.3 g 和11.82 cm；而只接種TR4 與空白對照組CK 相比，香蕉的葉片數和株高差異顯著，葉片數明顯低于對照組，株高和莖粗卻大于對照組；綜上表明當接種Sz-2+TR4 時，在有TR4 的致病作用干擾下，與只接種TR4 相比，Sz-2 能夠顯著提高香蕉的葉片數、莖粗、鮮重和株高；接種拮抗菌Sz-2+TR4 與只接種Sz-2 相比時，其相關的促生指標顯著低于只接種Sz-2 處理組，說明TR4 依然對香蕉的生長產生了一定的影響，促生拮抗菌Sz-2 的接種無法完全消除TR4 對香蕉生長的抑制作用，只能在一定程度上改善香蕉的生長。以上研究說明該Sz-2 對香蕉苗不僅具有較高的防病效果，而且還對香蕉具有顯著的促生效果，為香蕉促生抗病菌株的進一步田間開發(fā)應用提供一定的理論依據。

表5 拮抗菌Sz-2 對香蕉的促生長效果Table 5 Growth-promoting effects of antagonistic bacterium Sz-2 on banana

3 討論

香蕉枯萎病作為一種嚴重危害香蕉產業(yè)的真菌性土傳病害，尚無有效的防治方法，帶菌的吸芽、病株殘體及帶菌土壤都可以作為病原菌的傳染源[3]，目前利用化學藥劑來防治香蕉枯萎病病原菌TR4是一種迅速有效的方法，但往往會對土壤和水體環(huán)境造成破壞且過度使用易誘導病菌產生抗藥性。以現在可持續(xù)發(fā)展的農業(yè)生產目標來看，綠色環(huán)保無污染的生物制劑成為目前研究的熱點，生物防治是最有潛力和有效的方法，具有安全、有效、持久等優(yōu)點[5]。植物內生菌作為一種潛在的生物防治資源，其可以分泌多種抗菌物質和代謝產物抑制植物病菌，而且還可以在植物中定殖[21]。本研究從光葉苕子根內分離得到一株高效拮抗菌Sz-2，通過對其形態(tài)學、分子鑒定、生理生化特征進行分析，將菌株Sz-2 鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia)，對菌株進行拮抗測定，發(fā)現內生菌株Sz-2 可以在香蕉植株體內外表現出對TR4 的顯著抑制作用。目前，國內外利用嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌對香蕉枯萎病原菌TR4 進行抑制的研究文獻較為少見，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌在土壤、水體、空氣以及動植物體中廣泛存在，雖然其具有致病性和耐藥性，但其在自然界中的廣泛存在性必定和自然界具有很好的兼容性[22]。近年來，分離篩選出一系列具有良好生物防治效果的寡養(yǎng)單胞菌來開發(fā)生物菌劑逐漸成為熱點。Badri 等[23]從水稻根部和根際分離到一株嗜麥芽寡食單胞菌，能通過分泌β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶來顯著的抑制水稻稻瘟病，且顯著提高了株高、根長、每穴分蘗數、地上部和根系干重等促生參數；Aktas 等[24]分離獲得一株幾丁質降解菌，經鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，可以有效減少病原真菌的生長，并降解馬鈴薯甲蟲外骨骼幾丁質結構；Zahra 等[25]分離出一株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌菌株UN1512，能夠抑制草莓炭疽病的致病原，并且產生的VOCs 能夠促進番茄幼苗的生長，而且也有研究證明嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌能產生幾丁質酶[26]，所以嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌被用于生防菌防治植物病原菌具有很大的生防潛力。本研究中分離得到的拮抗菌Sz-2 也能抑制病原菌生長，電鏡掃描結果顯示，Sz-2 作用下TR4 菌絲生長畸形，交聯變形，且孢子數聚集增多，表明Sz-2 對TR4 的生長產生了顯著的影響。對香蕉枯萎病盆栽防效試驗結果顯示，菌株Sz-2 能較好的抑制TR4 對香蕉植株的侵染，且對香蕉球莖和葉片的防治效果可達69.66%±8.58%和84.60%±5.17%，推測其生防機理為：通過產生抗菌活性物質硝吡咯菌素、番紅菌素和吩嗪[27-28]及幾丁質酶[26]、葡聚糖酶[23]、蛋白酶、產生鐵載體和小分子脂肽類物質[29]等來抑制病原菌。由于幾丁質存在于昆蟲的外骨骼和真菌的細胞壁中，因此分泌幾丁質酶的菌株可以酶解昆蟲的外骨骼和真菌的細胞壁，干擾其生長[24,30]；而在真菌細胞壁中葡萄糖是主要的組成成分，葡聚糖酶可以水解真菌細胞壁中的葡萄糖鏈，進而阻斷病原真菌生長，且對孢子萌發(fā)和附著胞形成具有抑制作用[30]；硝吡咯菌素已被證明具有較強的抗病原真菌活性，有研究報道嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌能對致病菌的生長產生抑制作用，被廣泛用于抵抗真菌病害[27-31]；細菌鐵載體可與植物競爭根際土壤周圍有限的鐵，使病原菌無法吸收足夠的鐵元素，生長繁殖受到抑制，從而減輕對植物的危害，起到生物防治作用[29]；但也存在一種可能是細菌通過溶解無機磷、解鉀和提供鐵來促進植物生長，進而提高植物體的抗病蟲害能力，這也是一種潛在機制[9]，但具體的生防機理仍需后續(xù)試驗對其發(fā)酵液進行分析。

目前，寡養(yǎng)單胞菌屬的細菌在調節(jié)植物生長、高效聚磷和產鐵載體方面表現出良好的應用前景，應用比較廣泛。磷作為植物生長的必需營養(yǎng)元素，是植物體內眾多化合物的成分，參與植物的代謝過程，而土壤中的磷往往以有機無機態(tài)存在，植物難以利用，所以具有溶磷功能的細菌具有很大的開發(fā)潛力[32]。唐夢君[33]分離出一株高效聚磷和降解有機磷農藥的多功能菌株MET70，經鑒定為嗜麥芽寡營養(yǎng)單胞菌，且還具有促進作物生長的功能；鐵載體是在缺鐵土壤環(huán)境中部分微生物分泌的鐵螯合物，具有螯合Fe3+能力，可將土壤中存在的一些難溶性Fe3+轉化為菌體易利用的鐵，進而供給植物吸收利用[29]。徐敬昭等[29]從土壤中分離得到菌株S35，鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，具有蛋白酶和鐵載體產生能力，在植物促生方面具有一定的應用潛力；Santos 等[28]分離得到具有顯著鐵載體產生潛力和分泌抗生素活性物質的促生拮抗菌；嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌在解鉀方面的研究較少，但楊曉帆等[34]也分離出一株具有降解難溶性鉀的促生熒光假單胞菌，表明假單胞菌屬可能具有解鉀的潛力。上述研究發(fā)現的菌株在植物促生方面與本研究發(fā)現的菌株Sz-2 功能相類似，也具有溶解無機磷、解鉀、產鐵載體的促生功能，對香蕉苗具有顯著的促生效果[28-29,33-34]。另外，在本研究中發(fā)現，單獨接種TR4 的香蕉株高大于空白對照組，猜測可能是TR4 發(fā)酵液中含有部分活化的營養(yǎng)物質，導致香蕉株高增加，而且單獨接種TR4 的香蕉莖粗也大于空白對照組，這與Fan 等[17]和Li 等[18]的研究不一致，推測可能的原因是TR4 菌絲侵入香蕉球莖輸導組織中，導致香蕉莖維管束組織堵塞，香蕉球莖膨大，空腔變多[2]；當接種Sz-2+TR4 處理與單獨接種TR4 相比時，香蕉的葉片數、莖粗、鮮重和株高均高于只接種TR4，且差異顯著，這與Fan 等[17]和Li 等[18]的研究結果相符。綜上表明，寡養(yǎng)單胞菌是一個功能豐富的細菌，具有調節(jié)植物生長、高效聚磷、產鐵載體和解鉀等促生特性。

光葉紫花苕作為云南主推綠肥及農田主要間套作作物，挖掘其根部有益菌菌株，不但有助于開發(fā)潛在的工程菌資源，同時可作為菌劑結合綠肥研制功能型綠肥。種植香蕉是云南熱帶亞熱帶地區(qū)農業(yè)的主要產業(yè)之一，當前該產業(yè)受到了香蕉枯萎病的嚴重威脅。光葉紫花苕作為香蕉產區(qū)主要的覆蓋作物之一，經過對其根部生防拮抗菌的篩選，目前已鑒定出一株強拮抗TR4 的內生菌株，拮抗菌株嗜麥芽寡食單胞菌 (Stenotrophomonasmaltophilia) Sz-2 抑病機制及其大田防治效果還有待進一步研究和驗證。雖然從植物根內分離出的嗜麥芽寡食單胞菌Sz-2與臨床分離出的菌株相比致病性較低，但仍可能對人體和動物產生危害[35]。建議選擇利用嗜麥芽寡食單胞菌的工程菌或細菌代謝分泌物作為生物農藥進行病害防治；或通過對具有生防功能的嗜麥芽寡食單胞菌菌株中的致病基因和耐藥基因敲除，降低其致病性和耐藥性[36-37]；或通過基因工程和代謝工程改造，異源表達嗜麥芽寡食單胞菌相關活性成分的基因或基因簇，提高抑菌代謝產物的發(fā)酵效價，為微生物農藥產業(yè)化生產提供安全保障[29,38]。本研究表明，光葉紫花苕根內的Sz-2 菌株對香蕉枯萎病具有較好的防治作用，且對香蕉植株具有一定的促生效果，可作為研制香蕉枯萎病生防菌劑的候選菌株資源，同時可作為菌劑結合綠肥研制具有防控香蕉枯萎病的功能型綠肥，為香蕉促生抗病菌株的進一步田間開發(fā)應用提供一定的理論依據。

4 結論

菌株Sz-2 對香蕉枯萎病具有較好的防治作用，且對香蕉植株具有一定的促生效果，可作為研制香蕉枯萎病生防菌劑的候選菌株資源。