劉巖,凌琬茗,趙瑞雪,王浩

特應性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一種多發(fā)于兒童且發(fā)病率較高(10%～17%)的慢性炎性皮膚病,若診斷不及時可能繼發(fā)膿皰感染,甚至導致紅皮病的發(fā)生[1-2]。AD可能與遺傳、免疫系統(tǒng)、環(huán)境等多個方面有關[3-4]。近年來分子生物標志物在臨床應用中的研究越來越多,因此,尋找可靠的分子生物學指標對于AD的臨床早期識別及預后改善十分重要。外泌體廣泛分布于各種體液,對機體自身免疫疾病具有調(diào)節(jié)作用,且參與細胞生物學行為及組織修復等過程,取少許樣品即可在臨床上用于分析研究,且檢測標本容易獲取、創(chuàng)傷較小[5]。長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)是一種長度>200個堿基的反義RNA分子,在免疫疾病的發(fā)病和進展中發(fā)揮重要作用[6-7]。唐敏等[8]研究表明,LncRNA MIR155HG與系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫系統(tǒng)疾病有關。目前在AD患兒血漿外泌體中LncRNA MIR155HG的表達相關的報道較少。基于此,本研究檢測并比較LncRNA MIR155HG在AD患兒與健康兒童血漿外泌體中的表達差異,并以此為基礎分析其與病情進展之間的關系,期望為AD的臨床早期及時控制提供參考,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021年12月—2023年1月于河北省兒童醫(yī)院皮膚科就診的AD患兒118例(AD組)為研究對象,男58例,女60例,年齡1～14(6.72±3.36)歲,病程(2.11±0.47)年。以急性濕疹為主,表現(xiàn)為亞急性和慢性皮損,皮疹干燥肥厚,呈苔蘚樣變,發(fā)生于面頸、腘窩、肘窩、小腿等部位。另選同期健康體檢兒童120例作為健康對照組,男62例,女58例,年齡1～13(6.51±3.15)歲;排除標準:(1)測試當日有化妝品或護膚品使用;(2)近1周使用過抗生素;(3)存在皮損。AD組和健康對照組兒童性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會研究同意(LS臨床20210106),受試者監(jiān)護人知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①符合AD診斷標準[9];②測量部位無皮膚損傷;③近1個月無糖皮質(zhì)激素、抗生素及免疫抑制劑等使用史;④無其他基礎病、合并癥及家族遺傳史。(2)排除標準:①其他自身免疫性疾病;②感染性疾病;③惡性腫瘤。

1.3 觀測指標與方法 收集患兒確診后第2天、健康者體檢當天空腹靜脈血4 ml,肝素抗凝后,離心留取血漿,-70℃儲存待測。

1.3.1 血漿外泌體提取:(1)使用外泌體提取試劑盒(涿州捷融生物科技有限公司)分離血漿外泌體,磷鎢酸染色外泌體后,以透射電鏡(型號JEM-1230,長春百克生物科技股份公司)進行結(jié)果分析。(2)外泌體顆粒濃度采用納米粒度儀(型號Zetasizer,長春市中保牧生物科技有限公司)進行測定,樣品稀釋5 000倍,按照納米粒度儀操作說明設置檢測參數(shù)進行測量。(3)獲取血細胞、外泌體樣品、血漿,提取總蛋白,定量100 μg蛋白后,進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉操作,分別加入外泌體表面標志蛋白[CD9(1∶670)、CD63(1∶710)、TSG101(1∶710)、Calnexin(1∶690)](涿州捷融生物科技有限公司)一抗孵育20 h,添加羊抗兔二抗(1∶1 630)(河南祺祥科技生物有限公司)孵育3 h后,ECL試劑顯色,凝膠成像系統(tǒng)(型號SH-1720,長春市中保牧生物科技有限公司)拍照。

1.3.2 熒光定量PCR(qRT-PCR)法測定血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達水平:血漿外泌體總RNA采用TRIzol試劑(涿州捷融生物科技有限公司)提取,反轉(zhuǎn)錄試劑盒(河南祺祥科技生物有限公司)進行逆轉(zhuǎn)錄,得cDNA。使用qRT-PCR儀(型號eQ164CP,長春百克生物科技股份公司)并參照PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq)(涿州捷融生物科技有限公司)說明進行qRT-PCR反應,反應體系30 μl:SYBR Premix Ex Taq 18 μl,cDNA 2 μl,H2O 9 μl,上下游引物各0.5 μl。反應條件:92℃ 19 s、91℃ 17 s、57℃ 23 s、74℃ 18 s,共循環(huán)32次。LncRNA MIR155HG、GAPDH引物均由長春百克生物科技股份公司合成,LncRNAMIR155HG上游引物:5’-TGCGGCAAAGTGCT-TACAGTG-3’,下游引物:5’-CCAGTGCAGGGTCCG-AGGT-3’;GAPDH上游引物:5’-GAAGGTGAAGGTC-GGAGTC-3’,下游引物:5’-AAGATGGTGATGGG-ATTTC-3’。以2-ΔΔCt法計算LncRNA MIR155HG相對表達量。

1.3.3 AD積分指數(shù)(SCORAD)評價:對所有AD患兒進行SCORAD評分,SCORAD評分(0～103分)包含:皮損范圍(A)、皮損嚴重程度(B)、瘙癢和影響睡眠程度(C)。SCORAD總分計算公式為A/5+7B/2+C,評分越高表示AD病情越嚴重。依據(jù)評分分為輕度亞組(41例,評分<25分)、中度亞組(38例,25分≤評分≤50分)、重度亞組(39例,評分>50分)[9]。

2 結(jié) 果

2.1 血漿外泌體鑒定 (1)透射電鏡顯示:圓形脂質(zhì)雙層膜囊狀顆粒直徑約140 nm,且清晰可見,見圖1。(2)納米粒度儀檢測結(jié)果顯示:顆粒直徑為30～195 nm,單峰正態(tài)分布(峰值約54 nm),見圖2。(3)免疫印跡法顯示:外泌體樣品中外泌體標志蛋白(CD63、CD9、TSG101)表達較穩(wěn)定,Calnexin蛋白表達不穩(wěn)定,見圖3。表明純化樣品中外泌體顆粒大量存在。

圖1 血漿外泌體透射電鏡結(jié)果(磷鎢酸染色,×10 000)Fig.1 Transmission electron microscopy results of plasma exosomes (stained with phosphotungstic acid, × 10 000)

圖2 血漿外泌體納米粒度儀檢測結(jié)果Fig.2 Detection results of nanoparticle analyzer for plasma exosomes

圖3 血漿外泌體蛋白免疫印跡檢測結(jié)果Fig.3 Immunoblotting test results of plasma exosomes protein

2.2 2組血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達水平比較 AD組血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達水平高于健康對照組(2.85±0.85 vs.1.00±0.00,t/P=23.843/<0.001)。

2.3 3亞組血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達水平、SCORAD評分比較 輕度亞組、中度亞組、重度亞組AD患兒血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達水平、SCORAD評分依次升高(P均<0.01),見表1。

表1 不同嚴重程度AD患兒血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達水平及SCORAD評分比較Tab.1 Comparison of plasma exosomes LncRNA MIR155HG expression levels and SCORAD scores in children with different severity of AD

2.4 血漿外泌體LncRNA MIR155HG與SCORAD評分的相關性 AD患兒血漿外泌體LncRNA MIR155HG與SCORAD評分呈正相關(r=0.673,P<0.001)。

2.5 血漿外泌體LncRNA MIR155HG對中度、重度AD的診斷價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示,血漿外泌體LncRNA MIR155HG診斷中度AD的曲線下面積(AUC)為0.831(95%CI0.758～0.935),截斷值為2.13,敏感度為0.741,特異度為0.916,約登指數(shù)0.657;診斷重度AD的AUC為0.802(95%CI0.704～0.891),截斷值為3.31,敏感度為0.715,特異度為0.817,約登指數(shù)0.532;診斷中度和重度AD的AUC比較差異無統(tǒng)計學意義(Z/P=1.008/0.313),見圖4。

圖4 LncRNA MIR155HG診斷中度、重度AD的ROC曲線Fig.4 ROC curve of LncRNA MIR155HG in diagnosing moderate and severe AD

3 討 論

AD又被稱作可遺傳的過敏性皮炎,是多見于兒童及青少年的皮膚病,常表現(xiàn)為皮膚大面積紅斑、丘疹、頑固性瘙癢及皮膚干燥等癥狀,其發(fā)病可能與遺傳、免疫、環(huán)境及精神等因素有關[10]。臨床尚無特效治療方法,由于易復發(fā)、易騷癢等特征,其會對患兒及家屬造成嚴重影響[11-12],因此臨床急需可輔助診斷的分子生物標志物。

外泌體由細胞釋放,作為最小的細胞外囊泡之一,其密度為1.10～1.18 g/ml。細胞內(nèi)溶酶體微粒形成的多囊泡體受刺激后與質(zhì)膜融合,導致外泌體的釋放,外泌體相關蛋白CD9、CD63等均會在此過程被轉(zhuǎn)運[13-14]。本研究首先提取鑒別外泌體,染色后觀察(透射電鏡),可見圓形脂質(zhì)雙層膜囊狀顆粒,直徑約為140 nm。納米粒度儀檢測結(jié)果顯示顆粒主要分布于30～195 nm,且分散均一,直徑呈單峰正態(tài)分布曲線,峰值約在54 nm處。免疫印跡檢測結(jié)果顯示,CD63、TSG101、CD9外泌體標志蛋白在外泌體樣品穩(wěn)定表達。表明純化樣品中外泌體顆粒的存在。

外泌體能夠攜帶不同的具有生物活性的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸[信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、LncRNA、DNA等],并能有效地將此類活性物質(zhì)運輸至不同的受體細胞,從而改變受體細胞的生物活動[15-17]。MIR155HG是人染色體9p21上的高度保守重要LncRNA,也是微小RNA-155(miR-155)的宿主LncRNA,miR-155作為其前體序列與免疫系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展關系密切[18]。盧山明等[19]研究發(fā)現(xiàn),與健康人比較,血虛風燥型AD患者血清miR-155水平明顯升高。唐敏等[8]研究發(fā)現(xiàn),自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中LncRNA MIR155HG水平明顯高于健康對照組,且與疾病活動度有關,提示LncRNA MIR155HG可能為系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動度評估及預后判斷的分子標志物。因此推測LncRNA MIR155HG與免疫系統(tǒng)疾病AD的發(fā)生有關。本研究結(jié)果顯示,AD患兒血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達水平較健康兒童更高,且隨嚴重程度的增加逐漸升高。與上述相關研究趨勢一致,說明患兒血漿外泌體LncRNA MIR155HG的異常升高可能參與AD的發(fā)生與進展,分析原因,LncRNA MIR155HG及其前體序列miR-155可對AD患兒機體炎性因子進行調(diào)控,從而參與免疫應答反應。SCORAD評分是AD評估常用標準,可用于AD患者病情嚴重程度的評估[20]。此外,在本研究中AD患兒LncRNA MIR155HG與SCORAD評分呈正相關,進一步表明血漿外泌體LncRNA MIR155HG異常升高可能參與了AD病情的進展過程,LncRNA MIR155HG表達水平越高則表明病情越嚴重。為進一步探究血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達水平與AD嚴重程度的關系,本研究分析了LncRNA MIR155HG的診斷價值,結(jié)果顯示血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達水平診斷中度、重度AD的AUC分別為0.831、0.802,截斷值分別為2.13、3.31,敏感度分別為0.741、0.715,特異度分別為0.916、0.817。表明血漿外泌體LncRNA MIR155HG對AD嚴重程度有較高的診斷價值,臨床上要關注血漿外泌體LncRNA MIR155HG高于2.13、3.31的AD患兒,這類患兒容易發(fā)展為中度、重度AD。

綜上所述,AD患兒血漿外泌體LncRNA MIR155HG高表達,且其可能與AD病情的嚴重程度有關,定時監(jiān)測其表達變化可用于AD患兒的病情評估。但關于LncRNA MIR155HG作用于AD患兒的具體機制仍需后續(xù)深入探索。

利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

劉巖:設計研究方案,課題設計,實施研究過程,論文撰寫;凌琬茗:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核;趙瑞雪:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;王浩:進行統(tǒng)計學分析