周雪琴,羅志華,黃從剛,康麗,黃喬春

膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤,占顱腦腫瘤的80%以上[1]。膠質(zhì)瘤的治療包括手術(shù)、放化療等,但治療后腫瘤易復(fù)發(fā)或形成耐藥性,患者預(yù)后不佳[2]。深入研究膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制,有助于膠質(zhì)瘤早期診斷及預(yù)后判斷。胰高血糖素樣肽-1受體(glucagon like peptide 1 receptor,GLP-1R)是一種胰高血糖素樣肽 1激素的受體,參與胰島素分泌的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[3]。研究表明,在前列腺癌、胰腺癌等惡性腫瘤中均存在GLP-1R異常表達(dá)的現(xiàn)象,GLP-1R能夠通過(guò)激活核因子κB信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[4-5]。二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4, DPP4)是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白和絲氨酸外肽酶,參與葡萄糖和胰島素代謝過(guò)程。研究表明,DPP4在乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中表達(dá)升高,其能激活雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移和侵襲[6-7]。研究發(fā)現(xiàn),鼠熱驚厥動(dòng)物模型中,DPP4能夠通過(guò)調(diào)節(jié)GLP-1/GLP-1R信號(hào)通路,調(diào)節(jié)γ-氨基丁酸能信號(hào)傳遞[8]。膠質(zhì)瘤中DPP4及GLP-1R可能存在相似的作用機(jī)制?，F(xiàn)通過(guò)研究GLP-1R、DPP4在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá),探討兩者的臨床預(yù)后意義,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月—2018年1月武漢市第一醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)治療的腦膠質(zhì)瘤患者88例為研究對(duì)象,留取腦膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織,常規(guī)石蠟包埋切片處理。其中男55例,女33例,年齡35～78(57.37±6.22)歲;Kamofsky功能狀態(tài)(Kamofsky performance status,KPS)評(píng)分:≥70分42例,<70分46例;腫瘤直徑≥5 cm 49例,<5 cm 39例;侵犯腦葉數(shù)<2個(gè)38例,≥2個(gè)50例;世界衛(wèi)生組織(WHO)分級(jí),Ⅰ～Ⅱ級(jí)39例,Ⅲ級(jí)49例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)(J201506034),患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)病理組織檢查明確診斷為腦膠質(zhì)瘤;②首次診治,既往無(wú)放化療等治療史;③患者及家屬能夠配合隨訪,病例資料和隨訪資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他器官系統(tǒng)的惡性腫瘤;②近3個(gè)月有心肌梗死、腦卒中等急危重癥疾病;③伴腦積水或腦部手術(shù)史。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 GLP-1R、DPP4蛋白檢測(cè):將術(shù)中獲取的腦膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織置于10%中性甲醛固定過(guò)夜,行石蠟包埋,組織切片,厚度4 μm,37℃溫水中展片后烘干2 h。PV9000兩步法免疫組化染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司。顯微鏡下(日本OLYMBUS,BX53型)觀察陽(yáng)性表達(dá)部位的染色強(qiáng)度和范圍,進(jìn)行免疫組化染色評(píng)分[9],評(píng)分根據(jù)染色強(qiáng)度(0分:無(wú)染色,1分:染色淺,2分:染色深)和染色面積(0分:<25%,1分:25%～50%,2分:>50%)的乘積評(píng)估。評(píng)分<2分為陰性表達(dá),≥2分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3.2 隨訪:患者自出院后進(jìn)行隨訪,每3個(gè)月電話隨訪1次,隨訪5年,隨訪截至2021年1月或患者死亡。主要了解患者生存情況和疾病復(fù)發(fā)進(jìn)展情況等。

2 結(jié) 果

2.1 腦膠質(zhì)瘤中GLP-1R、DPP4 蛋白表達(dá) 腦膠質(zhì)瘤組織中GLP-1R陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜,DPP4陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞核,見(jiàn)圖1。腦膠質(zhì)瘤組織中GLP-1R的陽(yáng)性表達(dá)率為69.32%(61/88),明顯高于癌旁組織的25.00%(22/88),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=34.680,P<0.001);腦膠質(zhì)瘤組織中DPP4的陽(yáng)性表達(dá)率為72.73%(64/88),明顯高于癌旁組織的35.23%(31/88),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.908,P<0.001)。相關(guān)分析結(jié)果顯示,腦膠質(zhì)瘤中GLP-1R與DPP4表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.604,P<0.001)。

注:GLP-1R.胰高血糖素樣肽-1受體;DPP4.二肽基肽酶4。圖1 腦膠質(zhì)瘤中GLP-1R、DPP-4蛋白表達(dá)(免疫組化染色,×200)Fig.1 GLP-1R and DPP-4 protein expression in glioma (immunohistochemical staining, × 200)

2.2 腦膠質(zhì)瘤組織中GLP-1R、DPP4蛋白表達(dá)在不同臨床參數(shù)中比較 腦膠質(zhì)瘤組織中GLP-1R、DPP4蛋白表達(dá)在不同性別、年齡、腫瘤直徑、侵犯腦葉數(shù)間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);KPS評(píng)分<70分、WHO分級(jí)Ⅲ級(jí)腦膠質(zhì)瘤患者GLP-1R、DPP4蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于KPS評(píng)分≥70分、WHO分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 腦膠質(zhì)瘤組織中GLP-1R、DPP4的表達(dá)在不同臨床參數(shù)中差異比較 [例(%)]Tab.1 Comparison of differences in the expression of GLP-1R and DPP4 in glioblastoma tissues among different clinical parameters

2.3 GLP-1R、DPP4蛋白表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響 88例腦膠質(zhì)瘤患者隨訪4～60個(gè)月,生存時(shí)間為(23.57±3.76)個(gè)月。隨訪期間失訪4例,死亡49例,5年總體生存率為41.67%(35/84)。GLP-1R陽(yáng)性表達(dá)組5年總體生存率為26.32%(15/57),明顯低于陰性表達(dá)組的74.07%(20/27),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.128,P<0.001);DPP4陽(yáng)性表達(dá)組5年總體生存率為31.15%(19/61),明顯低于陰性表達(dá)組的69.57%(16/23),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.670,P=0.003),見(jiàn)圖2。

注:GLP-1R.胰高血糖素樣肽-1受體;DPP4.二肽基肽酶4。圖2 GLP-1R、DPP4蛋白表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響Fig.2 The impact of GLP-1R and DPP4 protein expression on the prognosis of glioma patients

2.4 Cox回歸分析影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素 以腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后為因變量,以上述結(jié)果中P<0.05項(xiàng)目為自變量,進(jìn)行多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示,腦膠質(zhì)瘤組織中GLP-1R陽(yáng)性表達(dá)、DPP4陽(yáng)性表達(dá)、WHO分級(jí)Ⅲ級(jí)及KPS評(píng)分<70分是影響患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 多因素Cox回歸模型分析影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素Tab.2 Multivariate Cox regression model analysis of risk factors affecting the prognosis of glioma patients

3 討 論

膠質(zhì)瘤是原發(fā)于顱內(nèi)神經(jīng)上皮的惡性腫瘤。膠質(zhì)瘤惡性程度高,增殖迅速且呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng),腫瘤治療后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,具有較高的致殘率和致死率,嚴(yán)重威脅人民健康[10]。近年來(lái)分子病理學(xué)研究證明,膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展與癌基因的激活、端粒酶的丟失及非整倍體等因素有關(guān),為膠質(zhì)瘤患者早期診斷、臨床預(yù)后判斷及治療方案的選擇提供理論基礎(chǔ)[11]。但目前尚無(wú)有效預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。

胰高血糖素樣肽-1是一種由腸道L細(xì)胞分泌的多肽激素,在受到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如葡萄糖、脂肪等刺激下釋放[12]。胰高血糖素樣肽-1通過(guò)其受體GLP-1R發(fā)揮作用。GLP-1R屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員,胞外N端由3個(gè)二硫鍵形成球狀結(jié)構(gòu)域,GLP-1R激活后具有葡糖糖依賴性促進(jìn)胰島素分泌的作用[13]。另有研究發(fā)現(xiàn),GLP-1R激活后能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的內(nèi)分泌、生長(zhǎng)及分化等重要作用[4]。本研究中,膠質(zhì)瘤組織中GLP-1R的表達(dá)顯著升高,與膠質(zhì)瘤患者WHO分級(jí)及KPS評(píng)分有關(guān),表明GLP-1R的表達(dá)上調(diào)促進(jìn)膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。膠質(zhì)瘤中GLP-1R升高的機(jī)制尚不清楚。研究表明,膠質(zhì)瘤中G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(G-protein coupled receptor kinase 2,GRK2)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,抑制凋亡[14]。研究表明,GRK2還能夠激活并促進(jìn)GLP-1R的表達(dá)[15]。因此,膠質(zhì)瘤中GLP-1R表達(dá)升高可能與調(diào)控其表達(dá)的GRK2升高有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),GLP-1R的表達(dá)能夠通過(guò)激活下游乙?；?的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng),在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中予以GLP-1R抑制劑治療后,腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移明顯受到抑制[16]。本研究發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)瘤中GLP-1R的陽(yáng)性表達(dá)膠質(zhì)瘤患者生存預(yù)后較差,提示GLP-1R是評(píng)估膠質(zhì)瘤預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。有學(xué)者報(bào)道,GLP-1R的活化能夠促進(jìn)化療耐藥基因多藥耐藥相關(guān)蛋白1和P-糖蛋白的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑等化療藥物耐藥性形成[17]。因此, GLP-1R可能是作為一種促癌因子,通過(guò)調(diào)控下游癌基因信號(hào)途徑的傳導(dǎo),參與膠質(zhì)瘤的腫瘤進(jìn)展,導(dǎo)致患者的不良生存預(yù)后。

DPP4是一種Ⅱ型跨膜蛋白,又稱為CD26。結(jié)構(gòu)上,DPP4具有短的6個(gè)氨基酸胞質(zhì)尾,屬于絲氨酸蛋白酶S9B家族,廣泛表達(dá)于骨髓衍生細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等。功能上,DPP4能與多種細(xì)胞表面分子相互作用,參與T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的分化、成熟及遷移,并影響細(xì)胞因子的分泌等多種生物學(xué)功能[18]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),膀胱癌、乳腺癌等惡性腫瘤中DPP4表達(dá)上調(diào),其通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、炎性反應(yīng)、細(xì)胞黏附和細(xì)胞調(diào)亡等過(guò)程,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6,19]。本研究中,膠質(zhì)瘤中DPP4表達(dá)顯著上調(diào),這與既往學(xué)者在低級(jí)別膠質(zhì)瘤中報(bào)道的結(jié)果一致[20]。膠質(zhì)瘤中DPP4表達(dá)上調(diào)與非編碼RNA調(diào)控異常有關(guān)。有研究報(bào)道,miR-152能夠結(jié)合并抑制DPP4的表達(dá),抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲,腫瘤發(fā)生時(shí)miR-152表達(dá)下調(diào),導(dǎo)致DPP4過(guò)度表達(dá),促進(jìn)腫瘤的惡性增殖和遷移[21]。本研究中,DPP4表達(dá)與膠質(zhì)瘤不良臨床病理特征有關(guān),提示DPP4作為一種促癌基因,其表達(dá)升高促進(jìn)膠質(zhì)瘤的疾病進(jìn)展。既往研究表明,腫瘤抑制因子p53的表達(dá)能夠促進(jìn)DPP4的蛋白降解,導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化及鐵死亡發(fā)生,發(fā)揮腫瘤抑制效應(yīng),膠質(zhì)瘤發(fā)生時(shí)p53基因突變導(dǎo)致DPP4蛋白積累,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞鐵死亡減少[22]。此外,膠質(zhì)瘤發(fā)生時(shí)DPP4還能夠促進(jìn)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá),進(jìn)而激活p62/Keap1/Nrf2信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[23]。本研究中,DPP4陽(yáng)性表達(dá)是影響膠質(zhì)瘤患者不良生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,表明DPP4是評(píng)估膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。分析其原因,可能是DPP4的表達(dá)上調(diào)能降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物治療的敏感性。有學(xué)者報(bào)道,高表達(dá)DPP4的腫瘤細(xì)胞能夠抑制腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞,介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸,同時(shí)通過(guò)分泌促炎性細(xì)胞因子,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑等化療藥物的耐藥性,導(dǎo)致患者不良預(yù)后[18]。同時(shí),本研究顯示,GLP-1R與DPP4在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)呈顯著正相關(guān),兩者之間的相互作用機(jī)制尚不清楚。研究報(bào)道,DPP4通過(guò)裂解激活GLP1,生成肽酪氨酸和神經(jīng)肽Y,兩者能夠結(jié)合GLP-1R 等配體,促進(jìn)下游信號(hào)傳遞[24]。因此,筆者推測(cè),膠質(zhì)瘤中DPP4和GLP-1R可能發(fā)揮協(xié)同促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的生物學(xué)作用,值得臨床深入研究,以探索膠質(zhì)瘤的新治療靶點(diǎn)。

綜上所述,膠質(zhì)瘤中GLP-1R、DPP4蛋白表達(dá)上調(diào),兩者表達(dá)與WHO分級(jí)及KPS評(píng)分有關(guān),共同參與促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。膠質(zhì)瘤組織中GLP-1R、DPP4陽(yáng)性表達(dá)是患者不良生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,可能是新的膠質(zhì)瘤預(yù)后評(píng)估的腫瘤標(biāo)志物,值得臨床深入探討。但本研究缺乏深入的機(jī)制探索,有待今后擴(kuò)大樣本量及基礎(chǔ)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。

利益沖突:所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

周雪琴:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過(guò)程,論文撰寫;羅志華:提出研究思路,資料搜集整理;黃從剛:分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;康麗:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,論文修改;黃喬春:課題設(shè)計(jì),論文撰寫