胥成朗,李強(qiáng),譚承睿,肖文峰,蔣正方

高血壓性腦出血是神經(jīng)外科常見病,一般是由高血壓引起的顱內(nèi)動(dòng)脈、靜脈和毛細(xì)血管破裂,嚴(yán)重危及患者生命[1-2]。高血壓性腦出血占所有自發(fā)性顱內(nèi)出血的50%～70%,具有很高的致殘率和致死率,30%以上的幸存者有不同程度的殘疾,給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。基于高血壓性腦出血的危險(xiǎn)性和危害性,迫切需要尋找與疾病發(fā)生、病情嚴(yán)重程度和預(yù)后評(píng)估相關(guān)的有效治療策略。miRNAs具有高度的序列保守性、表達(dá)時(shí)機(jī)和組織特異性,其表達(dá)失調(diào)已被證明是多種疾病發(fā)生和預(yù)后的生物標(biāo)志物[4]。miR-132是一種常見的miRNA,通過調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá),在炎性反應(yīng)、血管生成、腫瘤發(fā)生和其他生物過程中發(fā)揮廣泛的調(diào)節(jié)作用[5]。miR-34a表達(dá)于巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞中,與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[6]。然而,目前miR-132、miR-34a水平在高血壓性腦出血患者血清中的表達(dá)以及與預(yù)后的關(guān)系,尚未報(bào)道。因此,本研究通過檢測(cè)高血壓性腦出血患者血清miR-132、miR-34a的表達(dá)水平,分析二者表達(dá)與疾病發(fā)生、病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的相關(guān)性,為高血壓性腦出血的有效診治和預(yù)后預(yù)測(cè)提供參考依據(jù),報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年6月—2022年6月西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、四川綿陽四〇四醫(yī)院神經(jīng)外科治療高血壓性腦出血患者120例為觀察組,根據(jù)格拉斯哥昏迷量表(GCS)評(píng)分[7]分為輕度亞組32例(13～15分),中度亞組58例(9～12分)和重度亞組30例(3～8分);根據(jù)出院3個(gè)月后格拉斯哥預(yù)后評(píng)分(GOS)[8]分為預(yù)后良好亞組76例(>3分)和預(yù)后不良亞組44例(1～3分)。另選取同期醫(yī)院門診健康體檢者120例作為健康對(duì)照組。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(KY-2019030、2017001),受試者或家屬知情同意并簽署知情同意書。本研究遵循《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①符合高血壓性腦出血相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9];②均經(jīng)頭顱CT檢查進(jìn)一步證實(shí);③年齡>18歲。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①頭顱外傷史患者;②長(zhǎng)期服用抗凝藥物引起的腦出血患者;③伴有嚴(yán)重的心、肺及肝腎功能不全患者;④病例資料不完整患者。

1.3 血清miR-132、miR-34a水平檢測(cè) 高血壓性腦出血患者入院次日、健康對(duì)照組體檢當(dāng)日清晨,采取受試者空腹肘靜脈血3～5 ml于干燥試管,離心留取血清放入-20℃冰箱中保存、待檢。采用RNA提取試劑盒(上海生工生物有限公司)提取血清樣品總RNA,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測(cè)血清miR-132、miR-34a的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)說明書配置反應(yīng)體系。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性5 min、95 ℃變性10 s、60℃退火1 min、72℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。在ABI 7500 Fast系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR。以U6作為內(nèi)參,根據(jù)2-△△Ct計(jì)算miR-132、miR-34a基因的相對(duì)表達(dá)量。基因引物經(jīng)設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)后由上海生工生物工程有限公司合成,序列見表1。

表1 血清miR-132、miR-34a的qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT PCR primer sequences of serum miR-132 and miR-34a

2 結(jié) 果

2.1 2組血清miR-132、miR-34a比較 與健康對(duì)照組比較,觀察組血清miR-132、miR-34a 水平顯著升高(P<0.01),見表2。

表2 健康對(duì)照組與觀察組血清miR-132、miR-34a水平比較Tab.2 Comparison of serum miR-132 and miR-34a levels between the healthy control group and the observation group

2.2 不同嚴(yán)重程度亞組患者血清miR-132、miR-34a水平比較 血清miR-132、miR-34a水平比較,重度亞組>中度亞組>輕度亞組(P均<0.01),見表3。

表3 不同嚴(yán)重程度高血壓性腦出血患者血清miR-132、miR-34a水平比較Tab.3 Comparison of serum miR-132 and miR-34a levels in patients with hypertensive intracerebral hemorrhage of different severity levels

2.3 不同預(yù)后的高血壓性腦出血患者臨床資料比較 2亞組患者性別、年齡、吸煙史、飲酒史、BMI、舒張壓比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與預(yù)后良好亞組比較,預(yù)后不良亞組患者糖尿病比例、有家族遺傳史比例及收縮壓、血清miR-132、miR-34a升高(P<0.05或P<0.01),GOS評(píng)分顯著降低(P<0.01),見表4。

表4 預(yù)后良好亞組與預(yù)后不良亞組患者臨床資料比較Tab.4 Comparison of clinical data between patients with good prognosis subgroup and those with poor prognosis subgroup

2.4 多因素Logistic回歸分析高血壓性腦出血患者預(yù)后的影響因素 以高血壓性腦出血患者預(yù)后為因變量(預(yù)后不良=1,預(yù)后良好=0),以上述結(jié)果中P<0.05項(xiàng)目為自變量,進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,有糖尿病史及miR-132高、miR-34a高、收縮壓高是高血壓性腦出血患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05),GOS評(píng)分高為保護(hù)因素(P<0.05),見表5。

表5 多因素Logistic回歸分析高血壓性腦出血患者預(yù)后不良的影響因素Tab.5 Multivariate logistic regression analysis of prognostic factors in patients with hypertensive intracerebral hemorrhage

2.5 血清miR-132、miR-34a水平預(yù)測(cè)高血壓性腦出血患者預(yù)后的價(jià)值 繪制血清miR-132、miR-34a水平預(yù)測(cè)高血壓性腦出血患者預(yù)后的ROC曲線,并計(jì)算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示,血清miR-132高、miR-34a高及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)高血壓性腦出血患者預(yù)后的AUC分別為0.719、0.727、0.782,二者聯(lián)合優(yōu)于各自單獨(dú)預(yù)測(cè)價(jià)值(Z/P=2.588/0.011、2.453/0.014),見表6、圖1。

圖1 血清miR-132、miR-34a水平預(yù)測(cè)高血壓性腦出血患者預(yù)后的ROC曲線Fig.1 Receiver operating characteristic of serum miR-132 and miR-34a levels predicting the prognosis of hypertensive intracerebral hemorrhage patients

表6 血清miR-132、miR-34a水平對(duì)高血壓性腦出血患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值Tab.6 Predictive value of serum miR-132 and miR-34a levels for prognosis in patients with hypertensive intracerebral hemorrhage

3 討 論

高血壓性腦出血是高血壓疾病發(fā)展過程中最嚴(yán)重的并發(fā)癥,其具有高發(fā)病率、高殘疾率、高病死率的特點(diǎn)[10-11]。目前對(duì)于高血壓性腦出血尚缺乏有效的治療方法,且中、重度高血壓性腦出血治療難、預(yù)后差,這使得高血壓性腦出血的早期診斷和治療至關(guān)重要[12]。因此,尋找高血壓性腦出血發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)生物標(biāo)志物,對(duì)高血壓性腦出血早發(fā)現(xiàn)、早治療具有重大意義。miR-132、miR-34a都屬于miRNA基因家族的成員,是重要的調(diào)節(jié)因子,大量研究表明,它們?cè)诩?xì)胞增殖、分化、遷移、分泌和凋亡等不同生理?xiàng)l件下發(fā)揮著關(guān)鍵作用[13],其有望成為高血壓性腦出血早期診斷和治療的生物標(biāo)志物。

Gong等[14]發(fā)現(xiàn)miR-132的過表達(dá)可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,在神經(jīng)元中的表達(dá)增加,與慢性神經(jīng)性疼痛有關(guān),引發(fā)神經(jīng)炎性反應(yīng)和多巴胺能神經(jīng)變性。Xu等[15]發(fā)現(xiàn)miR-132是通過調(diào)節(jié)下游靶基因影響缺血性或非缺血性心力衰竭的多種病理過程,包括心肌肥大、纖維化、細(xì)胞凋亡、血管生成、鈣處理、神經(jīng)內(nèi)分泌激活、氧化應(yīng)激等,其作為生物標(biāo)志物在心血管疾病中有很好的診斷和治療潛力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-132在高血壓性腦出血患者血清中表達(dá)上調(diào),輕、中、重度亞組血清miR-132水平依次顯著升高,預(yù)后不良亞組血清miR-132表達(dá)水平顯著高于預(yù)后良好亞組,與以往研究結(jié)果相似,提示血清miR-132過表達(dá)可能通過神經(jīng)炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等過程促進(jìn)高血壓性腦出血的發(fā)生發(fā)展,且與患者預(yù)后密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),miR-34a可以導(dǎo)致炎性反應(yīng)、活性氧(ROS)產(chǎn)生,其與細(xì)胞增殖、凋亡、糖尿病發(fā)生等生理機(jī)制和疾病有密切關(guān)系[16-17]。Mone等[18]發(fā)現(xiàn)miR-34a會(huì)導(dǎo)致糖尿病患者的內(nèi)皮功能障礙和血管衰老,增加氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng),是血管衰老的生物標(biāo)志物。Wan等[19]發(fā)現(xiàn)在酒精性肝病患者體內(nèi)miR-34a過表達(dá)可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞相關(guān)的炎性反應(yīng)和血管生成加重肝損傷。本結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-34a在高血壓性腦出血患者血清中表達(dá)上調(diào),輕、中、重度亞組血清miR-34a水平依次顯著升高,預(yù)后不良亞組血清miR-34a表達(dá)水平顯著高于預(yù)后良好亞組,與以往研究結(jié)果相似,提示血清miR-34a高表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和血管衰老導(dǎo)致高血壓性腦出血的發(fā)生、發(fā)展,且與預(yù)后相關(guān)。Van den Berg等[20]發(fā)現(xiàn)miR-132、miR-34a均是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有前途的生物標(biāo)志物,因?yàn)樗鼈冏鳛樾攀箙⑴c發(fā)育和分化過程。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)血清miR-132、miR-34a二者聯(lián)合預(yù)測(cè)高血壓性腦出血患者預(yù)后的效能優(yōu)于血清miR-132、miR-34a各自單獨(dú)預(yù)測(cè)。研究表明,收縮壓、GOS評(píng)分對(duì)高血壓性腦出血患者臨床診斷和預(yù)后具有重要的意義[21]。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,miR-132高、miR-34a高、收縮壓高、GOS評(píng)分低、有糖尿病史是高血壓性腦出血患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素,提示應(yīng)密切關(guān)注上述因素,以便及時(shí)對(duì)患者采取干預(yù)措施,改善預(yù)后。

綜上所述,高血壓性腦出血患者血清中miR-132、miR-34a表達(dá)顯著升高,二者聯(lián)合可較好地判斷高血壓性腦出血預(yù)后。然而血清miR-132、miR-34a參與高血壓性腦出血發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究,將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)挖掘,更全面地揭示它們?cè)诟哐獕盒阅X出血中的作用機(jī)制。

利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

胥成朗:實(shí)施研究過程,論文撰寫;李強(qiáng)、譚承睿:數(shù)據(jù)收集,統(tǒng)計(jì)分析;肖文峰:課題設(shè)計(jì),分析試驗(yàn)數(shù)據(jù);蔣正方:修改論文,論文終審