達(dá)熱卓瑪 徐一達(dá) 沈 婧

（1.海西州疾病預(yù)防控制中心業(yè)務(wù)科，青海 海西蒙古族藏族自治州，817000；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122）

韭菜子是百合科蔥屬韭（Allium tuberosum Rottler ex Sprengle.）的種子，又名韭子。質(zhì)硬，氣特異，味微辛[1]。具有溫中、補(bǔ)虛、益陽、調(diào)和臟腑的作用[2-4]。被衛(wèi)生部列為保健品之一，國內(nèi)外對韭菜子的研究很少，且大多以韭菜子抗菌、抗氧化等為主[5-7]。從我們掌握的文獻(xiàn)資料來看，國外還未對韭菜子進(jìn)行過甾體皂苷抗疲勞功效方面的研究，國內(nèi)也鮮有研究。本研究對韭菜子中的皂苷成分進(jìn)行了提取和鑒別，并探討了其抗疲勞作用，為韭菜子甾體皂苷用于臨床抗疲勞作用提供一定依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

韭菜子：購于安徽亳州藥材市場。實(shí)驗(yàn)動物：昆明小 白鼠［生產(chǎn)企業(yè)：上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SYXK (蘇) 2012-0002］，雌雄各半，每只（20±5）g；飼養(yǎng)環(huán)境：屏障環(huán)境，清潔級（小鼠）。無水乙醇、硫酸、茴香醛、冰醋酸、乙酸乙酯、石油醚（30 ～60℃）、正丁醇等分析純有機(jī)試劑（生產(chǎn)企業(yè)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氫化可的松（生產(chǎn)企業(yè)：太極集團(tuán)西南藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：090103）；血乳酸試劑盒（生產(chǎn)企業(yè)：艾萊薩生物科技有限公司，批號：E20200101A）；對照品：實(shí)驗(yàn)室分離得到；MCI色譜柱（10150 cm）（生產(chǎn)企業(yè)：日本三菱化學(xué)公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

植物粉碎機(jī)（生產(chǎn)企業(yè)：常州市金球設(shè)備有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（生產(chǎn)企業(yè)：上海申順生物科技有限公司）、循環(huán)水式多用真空泵（生產(chǎn)企業(yè)：鄭州長城有限公司，型號：SHB-BB型）、恒溫油水浴鍋（生產(chǎn)企業(yè)：江蘇金怡儀器科技有限公司，型號：YD2A）、精密電子天平（生產(chǎn)企業(yè)：瑞士梅特勒，型號：ME104E）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 韭菜子中皂苷的鑒別

2.1.1 樣品提取

將10 kg干燥的生品韭菜子粉碎，經(jīng)40目過濾篩，放入提取罐，用6～8倍量50%乙醇回流提取2 h，冷卻，過濾，上清液濃縮干燥至無醇味，上樣 MCI色譜柱（10×150 cm），先用離子水，10%乙醇、45%乙醇、70%乙醇和90%乙醇梯度洗脫，70%乙醇部位以甾體皂苷為主，鑒于此，收集70%乙醇部位，減壓濃縮干燥待用[8-10]。

2.1.2 樣品定性檢測

醋酐-濃硫酸反應(yīng)（Liebermann-Burchard），在試管中將

2.1.1 中得到的濃縮物少量溶于乙酸酐，再沿試管壁加入濃硫酸，觀察并記錄[11]。

五氯化銻反應(yīng)(Kahlenberg)，將少量2.1.1中得到的濃縮物與五氯化銻的氯仿溶液反應(yīng)，觀察顏色變化。

三氯醋酸反應(yīng)(Rosen-Heimer)，將2.1.1中得到的濃縮物制成溶液滴在濾紙上，加三氯醋酸試劑一滴，加熱，進(jìn)行觀察記錄[12]。

2.2 韭菜子中皂苷的提取工藝

2.2.1 測定波長的選擇

取對照品10 mg，用甲醇定容至10 mL，充分混勻使之溶解，得到對照品溶液，其濃度1 mg/mL。

用移液槍精密移取1.5 mL對照品溶液，真空蒸發(fā)至干，迅速用移液槍精準(zhǔn)加入0.8 mL的高氯酸，0.2 mL的5% 香草醛-冰醋酸，于60 ℃水浴顯色，15 min后流水冷卻，加入5 mL冰醋酸，搖勻，以不加對照品的管為空白，立即在200～800 nm波長下掃描，測定吸光度，記錄數(shù)據(jù)[13-14]。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取2.2.1配置的對照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL于10 mL比色管中，揮干溶劑，加高氯酸至刻度，置25 ℃水浴中保溫25 min，取出冷卻至室溫，顯色，得質(zhì)量濃度分別為0.002 mg/mL、0.004 mg/mL、0.006 mg/mL、0.008 mg/mL、0.010 mg/mL、0.012 mg/mL的溶液，以高氯酸為空白試劑，在454 nm處測量吸光度，回歸分析[15-16]。

2.2.3 酒精濃度對皂苷提取率的影響

取6份準(zhǔn)確稱定的2 g韭菜子粉末置于5個(gè)干燥潔凈150 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入50 mL的水及30%、40%、50%、55%、60%乙醇溶液。恒溫60 ℃，靜置1 h過濾，提取3次，測定吸光度。

2.2.4 料液比對皂苷提取率的影響

取5份準(zhǔn)確稱定的2 g韭菜子粉末置于5個(gè)干燥潔凈150 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入12.5 mL、25.0 mL、50.0 mL、100.0 mL、200.0 mL的60%乙醇。恒溫60 ℃震蕩1 h，提取3次，取濾液，測定吸光度。

2.2.5 提取溫度對皂苷提取率的影響

取7份準(zhǔn)確稱定的2 g韭菜子粉末置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL的60%乙醇，分別控制在恒溫20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃下震蕩1 h，提取3次，取濾液，測定吸光度。

2.2.6 提取時(shí)間對皂苷提取率的影響

取6份準(zhǔn)確稱定的2 g韭菜子粉末置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 60%乙醇，分別恒溫60 ℃ 1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，靜置過濾，提取3次，取濾液，測定吸光度。

2.3 韭菜子抗疲勞作用

2.3.1 建立陽虛小鼠模型

選取60只小鼠，6周齡，體重20～25 g，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，編號后隨機(jī)分成3組，每組20只。除空白對照組外，余組肌注氫化可的松25 mg/kg，連續(xù)7 d［17-18］。

2.3.2 游泳力竭實(shí)驗(yàn)

造模后，將2.1中的樣品按1 g/kg的劑量與純凈水制成混懸液灌胃治療組，空白對照組、模型組給予等體積純凈水，連續(xù)10 d。末次給藥后1 h，取每組10只尾部負(fù)重體重10%的鉛絲，投入體積為35 cm×33 cm×20 cm、水溫為（28±1）℃的圓形玻璃缸內(nèi)，頭部無力游出水面7 s記錄為游泳時(shí)間（即抗疲勞時(shí)間）；另外每組10只尾部負(fù)重體重4%的鉛絲，投入體積為35 cm×33 cm×20 cm、水溫（28±1）℃的圓形玻璃缸中，游泳10 min，休息15 min后眼球采血，測定血清中的乳酸值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

建立數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，根據(jù)正態(tài)分布檢驗(yàn)方差齊性，選擇單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用最小顯著性差異法（LSD），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 韭菜子中皂苷的鑒別

醋酐-濃硫酸反應(yīng)（Liebermann-Burchard），觀察發(fā)現(xiàn)呈黃-紅-紫-藍(lán)-綠色等變化，最后褪色。

五氯化銻反應(yīng)（Kahlenberg），將2.1.1中得到的濃縮物少量與五氯化銻的氯仿溶液反應(yīng)，干燥加熱60 ℃時(shí)顯紫色。

三氯醋酸反應(yīng)（Rosen-Heimer），加熱后濾紙上生成紅色并漸變?yōu)樽仙?。在同樣?shí)驗(yàn)條件下，三萜皂苷加熱100 ℃才會生成紅色，再變?yōu)樽仙?，而樣品反?yīng)更快，加熱至60 ℃即呈紅色，之后變?yōu)樽仙?，由此推測樣品含甾體皂苷。

皂苷水解成苷元、羥基脫水成雙鍵、雙鍵移位、分子間縮合、使脂環(huán)上產(chǎn)生共軛雙鍵而與濃硫酸等反應(yīng)呈現(xiàn)多種不同的色調(diào)，或在紫外光下呈現(xiàn)熒光。顯色反應(yīng)的快慢主要決定于脂環(huán)上原來存在的雙鍵的多少、羥基的多少，脂環(huán)上原有共軛雙鍵的呈色很快，環(huán)上只有孤立雙鍵的呈色慢，完全飽和、羥基又少的不呈色。甾體皂苷的顯色反應(yīng)比三萜皂苷快，因?yàn)槿浦h(huán)上的碳原子甲基取代多而變化稍慢，顯示韭菜子70%洗脫液中含有甾體皂苷。

3.2 韭菜子中皂苷的提取工藝

3.2.1 測定波長的選擇

見圖1，標(biāo)準(zhǔn)品在454 nm附近處出現(xiàn)峰型穩(wěn)定的次高峰，而韭菜子提取液也在454 nm波長附近出現(xiàn)了峰型單一的次高峰，經(jīng)多次掃描，峰型穩(wěn)定，漂移較小，可以認(rèn)為是同一物質(zhì)，由此將454 nm作為韭菜子中皂苷的測定波長。

圖1 200～1000nm韭菜子提取液皂苷吸光度曲線

3.2.2 酒精濃度對皂苷提取率的影響

乙醇濃度在0%到50%期間皂苷提取率隨著度數(shù)的增加而增大，當(dāng)50%時(shí)提取效果最好，而超過50%后，提取率開始降低，見圖2。

圖2 不同乙醇濃度提取皂苷的提取率

3.2.3 料液比對皂苷提取率的影響

料液比在1:6.25到1:200范圍內(nèi)，隨著溶劑量的增加，提取率遞增，見表1。料液比越大，表明細(xì)胞液與胞外溶劑間的濃度差越大，活性物質(zhì)的擴(kuò)散速率也就越快。鑒于后期的濃縮成本及工藝復(fù)雜性等因素，在料液比為1:12.5至1:25區(qū)間的皂苷提取率趨于平穩(wěn)。

表1 不同料液比對韭菜子中皂苷提取率的影響

3.2.4 提取溫度對皂苷提取率的影響

見圖3，隨提取溫度的增加，皂苷的提取率顯著上升。這是由于溫度升高皂苷溶于乙醇時(shí)吸收熱量,根據(jù)平衡移動原理,當(dāng)溫度升高時(shí),平衡有利于向吸熱的方向移動。在這期間，皂苷的提取率隨溫度升高而增大，但溫度達(dá)到60 ℃后提取率開始降低。

圖3 韭菜子不同提取溫度皂苷提取率

3.2.5 提取時(shí)間對皂苷提取率的影響

見圖4，提取時(shí)間越長，皂苷提取率越高，而4 h之后達(dá)到一定的穩(wěn)定狀態(tài)，往后時(shí)間對提取率的影響并不大。

圖4 韭菜子在不同提取時(shí)間的皂苷提取率

3.2.6 最優(yōu)條件分析

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取六組平行樣品， 測得 在乙醇濃度50%，溫度60 ℃，料液比1:25，提取4 h，韭菜子總皂苷含量的均值為3.28%，見表2。

表2 韭菜子中總皂苷含量測定

3.3 韭菜子甾體皂苷對陽虛模型小鼠的影響

空白組、模型組、治療組在小鼠游泳力竭時(shí)間和血乳酸含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），為明確具體差異，經(jīng)LSD法進(jìn)行組內(nèi)比較，得出模型組與空白對照組相比，小鼠游泳力竭時(shí)間顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型建立效果理想。治療組與空白組 比較，小鼠游泳力竭時(shí)間 有增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），較模型組顯著延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）； 模型組與空白組比較，血乳酸含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療組與空白組比較，血乳酸含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），較模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 韭菜子甾體皂苷對陽虛小鼠游泳時(shí)間和血乳酸（LAC）的影響（±s）

表3 韭菜子甾體皂苷對陽虛小鼠游泳時(shí)間和血乳酸（LAC）的影響（±s）

注：*P＜0.05，**P＜0.01；1=空白組，2=模型組，3=治療組。

組別只數(shù)時(shí)間（s）血乳酸（mmol/L）空白細(xì)110325.57±36.036.81±0.55模型組210237.78±40.807.74±1.04治療組310375.96±59.656.04±0.84 P＜0.001＜0.001 F 22.495** 10.385**LSD2＜1，3**；3＞1*，3＞2**2＞1*，3**；3＜1*，3＜2**

4 討論

韭菜子提取物抗菌、抗氧化、抗疲勞作用已有大量文獻(xiàn)報(bào)道[19-20]。為進(jìn)一步明確韭菜子中抗疲勞的具體有效成分，此次研究將韭菜子提取物進(jìn)一步分離，通過顯色反應(yīng)，鑒定韭菜子中的皂苷為甾體皂苷，并分析了不同酒精濃度、料液比、溫度及提取時(shí)間對皂苷提取率的影響， 發(fā)現(xiàn)在50%乙醇，60 ℃，料液比1:25，提取4 h條件下韭菜子總皂苷含量的均值為3.28%，是最佳提取工藝條件。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組小鼠與空白對照組相比，小鼠游泳力竭時(shí)間顯著減少 （P＜0.05）且血乳酸含量增加（P＜0.05），證明建模效果良好。 治療組小鼠游泳力竭時(shí)間較模型組和空白組明顯延長（P＜0.05），且治療組小鼠血乳酸含量顯著低于模型組（P＜0.05），提示 韭菜子甾體皂苷能顯著降低小鼠運(yùn)動過程中的乳酸堆積，從而緩解小鼠體力疲勞，提高小鼠的運(yùn)動耐力，這與陶永梅[20]、閆東[21]的研究結(jié)果一致。韭菜子甾體皂苷降低血乳酸水平的機(jī)制主要考慮兩個(gè)方面：根據(jù)《羅氏會約醫(yī)鏡》[22]中記載韭菜子入肝經(jīng)、腎經(jīng)，現(xiàn)代也有文獻(xiàn)研究其有溫補(bǔ)肝腎的作用,韭菜子中的甾體皂苷通過改善肝、腎功能，升高 Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶，促進(jìn)小鼠體內(nèi)的乳酸更快轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟腔蛱窃璠23-24]；二是通過降低MDA、NO含量，提高肝臟中T-SOD、GSH-PX 酶活力，使小鼠在相同強(qiáng)度的運(yùn)動中可以利用更多的氧氣，運(yùn)動肌就會有更多的血氧供應(yīng)，從而加速肌肉對乳酸的代謝，減少乳酸堆積。

韭菜是一種適應(yīng)力極強(qiáng)的植物，在我國西部高海拔地區(qū)也有廣泛種植，極具開發(fā)價(jià)值，希望通過以上研究能夠?yàn)橄乱徊窖芯块_發(fā)韭菜子甾體皂苷類中藥新藥提供理論參考，使韭菜子食藥領(lǐng)域得到更廣闊的應(yīng)用。另外，由于 分離工作量較大且耗時(shí)，單體化合物的藥理活性和構(gòu)效關(guān)系有望在今后得到進(jìn)一步研究。