李程呈 馬春宇

(1錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,遼寧 錦州 121000;2錦州市婦嬰醫(yī)院檢驗(yàn)科)

2型糖尿病是由于胰島素抵抗導(dǎo)致糖代謝紊亂,引起的內(nèi)分泌代謝障礙疾病,具有遺傳傾向,患者血糖及尿糖長期異常增高,常伴有心腦血管、腎臟、神經(jīng)、易發(fā)感染等多種嚴(yán)重并發(fā)癥〔1,2〕。殼寡糖(COS)為殼聚糖降解產(chǎn)物,研究報(bào)道其可改善機(jī)體免疫力、抗腫瘤〔3〕、抗氧化〔4〕、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)血脂等〔5〕。依據(jù)改良姜驪等〔6〕前期研究,本實(shí)驗(yàn)成功建立2型糖尿病小鼠模型,并首次探討不同劑量COS對(duì)2型糖尿病小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及小鼠免疫功能及炎癥因子釋放的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠60只,體質(zhì)量18～25 g,鼠齡2～3個(gè)月,雌雄皆有,由云南省天然藥物研究中心動(dòng)物室提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(云)2018-0002。

1.2藥物與試劑 COS購于濟(jì)南海得貝生物公司;鏈脲佐菌素(STZ)購于美國Sigma公司;血糖試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司;CD4/CD8/CD3檢測試劑盒(流式細(xì)胞儀法-FITC/PE/PerCP)購自安捷倫生物(杭州)有限公司;流式細(xì)胞儀購于美國BD生物科技公司;腫瘤壞死因子(TNF)-α、C反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1酶聯(lián)免疫試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司;酶標(biāo)儀購于美國伯騰儀器有限公司。

1.3模型構(gòu)建 健康昆明小鼠于實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定飼養(yǎng)1 w,再于實(shí)驗(yàn)室高脂飲食4 w后,禁食16 h,將STZ溶于檸檬酸緩沖液中,以100 mg/kg的劑量給各劑量組小鼠腹腔注射0.1 mol/L檸檬酸緩沖液,對(duì)照組注射等量檸檬酸緩沖液。為了保證STZ引起的低血糖不導(dǎo)致小鼠死亡,小鼠腹腔注射STZ后6 h灌胃給予50%葡萄糖溶液,1 d內(nèi)小鼠自由飲用5%葡萄糖溶液及正常攝食。1 d后給予無菌處理過的自來水,3 d后采用尾靜脈采血技術(shù),使用血糖試劑盒檢測并記錄小鼠血糖值。糖尿病小鼠建模成功的標(biāo)準(zhǔn)是其空腹血糖≥11.1 mmol/L,對(duì)于建模成功的小鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),保證充足水和食物,并每天更換籠盒和墊料。

1.4建模成功標(biāo)準(zhǔn) 模型組及高、中、低劑量給藥組小鼠表現(xiàn)出典型的“三多一少”:尿量增多、飲水增多、攝食增多及體質(zhì)量下降,血糖升高。且小鼠反應(yīng)變得遲鈍、精神狀態(tài)不佳、毛發(fā)豎立且失去光澤度、弓背捲體、動(dòng)物變得緩慢等糖尿病癥狀。建模成功的糖尿病小鼠再隨機(jī)分為模型組和各劑量殼聚糖組。

1.5分組和給藥方法 選取60只SPF級(jí)昆明小鼠,隨機(jī)取12只作為對(duì)照組,48只小鼠用高脂飲食結(jié)合小劑量腹腔注射STZ的方法成功建立2型糖尿病小鼠模型,隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組及高劑量組,每組12只。對(duì)照組和模型組每天用0.9%生理鹽水灌胃處理,低、中、高劑量COS組分別每天用100、200、400 mg/kg COS灌胃給藥,連續(xù)30 d,最后1次給藥2 h后處死小鼠。給藥劑量根據(jù)COS的人體(體質(zhì)量60 kg)推薦最大攝入量0.5 g/d的10、20、40倍設(shè)置小鼠的低、中、高劑量組。給藥期間給予實(shí)驗(yàn)小鼠無菌的自來水、基礎(chǔ)飼料,每日更換小鼠籠內(nèi)的墊料。

1.6觀察指標(biāo) (1)體質(zhì)量和血糖:最后1次灌胃給藥前禁食12 h,最后1次給藥后2 h處死小鼠前稱量體質(zhì)量,并測量通過尾靜脈采血的方式,測量血糖水平。(2)脾臟和胸腺指數(shù):稱量解剖取出的脾臟和胸。記錄脾臟/胸腺的質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)值,此值即對(duì)應(yīng)的小鼠脾臟或胸腺指數(shù)。(3)免疫指標(biāo):于小鼠處死前使用毛細(xì)采血管進(jìn)行眼球后靜脈叢取血,使用肝素防止血液的快速凝結(jié),再利用流式細(xì)胞儀測定小鼠眼眶血中CD4+、CD8+表達(dá)水平,并計(jì)算CD4+/CD8+比值。(4)炎癥因子:取血方式如上所述,離心收集上清液,使用酶聯(lián)免疫試劑盒測定炎癥因子TNF-α、CRP、IL-6、 IL-1β、MCP-1的表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.15組體質(zhì)量和血糖比較 與對(duì)照組相比,模型組體質(zhì)量顯著下降(P<0.05),血糖水平顯著升高(P<0.05),各劑量組體質(zhì)量有所升高,血糖水平下降,且與模型組相比,中、高劑量組體質(zhì)量明顯增加,血糖水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 5組體質(zhì)量、血糖水平脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、免疫功能指標(biāo)比較

2.25組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)比較 相較于對(duì)照組,模型組,低、中劑量組胸腺和脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.05),高劑量組低于對(duì)照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);低、中、高劑量組顯著高于模型組(P<0.05)。見表1。

2.35組免疫功能指標(biāo)比較 模型組,高、中、低劑量組CD4+表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05);各劑量組顯著高于模型組,且中、高劑量組明顯高于低劑量組(P<0.05);5組CD8+表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.45組炎癥相關(guān)因子比較 模型組炎癥因子TNF-α、CRP、IL-6、IL-1β及MCP-1表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05);高、中、低劑量組顯著低于模型組(P<0.05);且高劑量組明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 5組炎癥因子比較

3 討 論

糖尿病是一種長期慢性疾病,可引發(fā)多種并發(fā)癥,發(fā)病率和致死率逐年升高〔7〕。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國糖尿病人群中2型糖尿病占90%以上〔8〕,糖尿病早期患者免疫功能顯著下降〔9〕,而目前患者對(duì)環(huán)孢霉素、硫唑嘌呤等免疫抑制劑治療有嚴(yán)重的不良反應(yīng)〔10,11〕。因此國內(nèi)外迫切尋求新的天然藥物作為降糖藥。COS是殼聚糖的降解產(chǎn)物,其分子量小,可溶于水,具有比殼聚糖更強(qiáng)的生物活性,且有較好的生物相容性及生物可降解性〔12〕。COS因其對(duì)機(jī)體免疫的調(diào)節(jié)作用、對(duì)抗腫瘤作用、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)〔13〕、改善血糖血脂〔14〕、促進(jìn)組織再生、降低膽固醇等生物活性已受到國內(nèi)外的大量關(guān)注。

胸腺是機(jī)體最大淋巴器官,其不僅是T淋巴細(xì)胞分化及發(fā)育成熟的場所,也是對(duì)血源性抗原發(fā)生免疫效應(yīng)的場所〔15〕。脾臟參與機(jī)體造血、貯血和過濾等作用,也是T細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要場所,參與機(jī)體免疫反應(yīng),脾臟受損增加2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)〔16〕。因此對(duì)胸腺/脾臟指數(shù)的檢測可以間接判斷機(jī)體的免疫功能狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn),糖尿病小鼠胸腺和脾臟萎縮,免疫功能抑制,且各劑量COS組對(duì)糖尿病小鼠的免疫抑制有所改善。T淋巴細(xì)胞亞群也是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫功能狀態(tài)的重要指標(biāo),CD4+/CD8+比值越低,提示機(jī)體的免疫功能下降。糖尿病患者CD4+與CD8+表達(dá)失衡,易誘發(fā)感染。本研究結(jié)果證實(shí),糖尿病小鼠免疫力下降,COS能夠劑量依賴性明顯改善糖尿病小鼠免疫功能抑制現(xiàn)象。

研究顯示,炎癥反應(yīng)在糖尿病病變及發(fā)生發(fā)展中起重要作用,炎癥因子的高表達(dá)導(dǎo)致病程的加重及更高的并發(fā)癥發(fā)生率〔17〕。IL-1β是IL-1在體液中的主要存在形式,與TNF-α均為血管炎癥的標(biāo)志性炎癥相關(guān)因子,研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者體內(nèi)TNF-α、IL-1β及IL-6表達(dá)水平顯著高于正常組〔18,19〕。CRP是機(jī)體受到外界刺激時(shí)在肝臟大量合成的急性蛋白質(zhì)〔20〕,TNF-α、IL-1β及IL-6的產(chǎn)生將會(huì)刺激CRP的急性合成,導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)失衡,將形成和促進(jìn)胰島素抵抗〔21〕。MCP-1是近年來廣受學(xué)者關(guān)注的趨化細(xì)胞因子,當(dāng)機(jī)體炎癥相關(guān)因子表達(dá)升高,將刺激單核-巨噬細(xì)胞大量分泌MCP-1,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生或加重〔22,23〕。因此,抑制該分子的表達(dá)有助于對(duì)糖尿病的治療。本文結(jié)果顯示,通過COS的干預(yù),糖尿病小鼠炎性相關(guān)指標(biāo)TNF-α、CRP、IL-6、IL-1β、MCP-1的表達(dá)量顯著降低,且COS劑量越大,降低愈明顯。

本實(shí)驗(yàn)通過成功構(gòu)建的2型糖尿病小鼠模型進(jìn)一步證明COS可劑量依賴性提高糖尿病小鼠的免疫功能、抑制炎癥反應(yīng),進(jìn)而可能增強(qiáng)小鼠抗炎抗感染能力。提示COS具有可觀的2型糖尿病臨床應(yīng)用前景,但其構(gòu)效關(guān)系及具體抗炎機(jī)制還需要更進(jìn)一步研究確定。