吳明媛 趙偉 趙遠(yuǎn) 毋亞坤 張瀚文

(焦作市人民醫(yī)院,河南 焦作 454000)

宮頸癌主要指發(fā)生在子宮陰道部及宮頸管的惡性腫瘤。一般采用化療、放療治療宮頸癌,但是效果較差,預(yù)后不良〔1,2〕。早期宮頸癌常無(wú)明顯癥狀和體征,宮頸可光滑或難與宮頸柱狀上皮異位區(qū)別。晚期癥狀根據(jù)癌灶累及范圍出現(xiàn)不同的繼發(fā)性癥狀。如尿頻、尿急、便秘、下肢腫痛等;癌腫壓迫或累及輸尿管時(shí),可引起輸尿管梗阻、腎盂積水及尿毒癥;晚期可有貧血、惡病質(zhì)等全身衰竭癥狀〔3,4〕。紫草素具有抗癌、抗炎、抗菌等作用,臨床也可以用于治療急、慢性肝炎、肝硬化〔5,6〕。紫草素可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,但其分子機(jī)制尚不是很明白〔7〕。本實(shí)驗(yàn)主要探究紫草素對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及其miR-214表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1藥物 紫草素購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,純度>99%。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只6周齡雌性 BALB/c 裸鼠(每組n=5)購(gòu)自河南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(中國(guó)鄭州)。

1.3材料 宮頸癌細(xì)胞株Hela(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù));胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司,批號(hào)NXA0544、NZE1147);胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司,批號(hào)2242B80);MTT試劑(美國(guó)Sigma公司,批號(hào)1313B12);Transwell小室(美國(guó)Corning公司,批20130204)。

1.4儀器 Q5實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Cell Signaling公司);PTC-200型熱循環(huán)儀(美國(guó)Bio-Rad公司);5415D型離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);F-4500型熒光定量檢測(cè)儀(日本HITACHI公司)。

1.5藥物處理 使用二甲基亞砜(DMSO)溶解紫草素,并使DMSO的終質(zhì)量濃度小于0.01 g/L,-20 ℃避光保存。

1.6細(xì)胞培養(yǎng)與分組 宮頸癌細(xì)胞Hela用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用不同濃度(4、8、16、32、64 μmol/L)的紫草素處理Hela細(xì)胞,記為4 μmol/L組、8 μmol/L組、16 μmol/L組、32 μmol/L組、64 μmol/L組;正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照(Con)組。將miR-NC、miR-214轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞,記為miR-NC組、miR-214組;將anti-miR-NC、anti-miR-214轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞,再用64 μmol/L紫草素處理,記為紫草素+anti-miR-NC組、紫草素+anti-miR-214組。

1.7MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞培養(yǎng)24 h,每孔加入20 μl MTT溶液,4 h后,加入150 μl/孔 DMSO溶液,反應(yīng)10 min,把酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)設(shè)置為490 nm,檢測(cè)各孔的吸光度(OD)值。

1.8平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 取細(xì)胞1×103個(gè)/孔接種于6孔板,直至出現(xiàn)肉眼可見的克隆,終止培養(yǎng),加入4%多聚甲醛固定15 min,分別加入結(jié)晶紫染液染色5 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,觀察克隆形成數(shù)。

1.9Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):將基質(zhì)膠加入小室的上室,孵育5 h,隨后加入各組細(xì)胞(3×104個(gè)/孔),在小室的下室加入含有PBS的培養(yǎng)液(600 μl/室),繼續(xù)培養(yǎng)24 h,多聚甲醛固定20 min,0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min,計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):基質(zhì)膠不加入小室的上室,其他操作方法與侵襲實(shí)驗(yàn)一樣。

1.10qPCR檢測(cè)miR-214表達(dá) TRIzol試劑提取細(xì)胞中總RNA,使用cDNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒進(jìn)行熒光定量。miR-214:上游引物 5′-CACTCTATATAGTGTATCTTTC-3′,下游5′-GGCTTTTAGTGTACGTCGTAATG-3′;U6 上游引物 5′-ACGTCACGAGCCGTCTCTCGTGA-3′,下游 5′-GG-CTCCAACGTACCGATCAGTA-3′。使采用2-ΔΔCt方法分析miR-214表達(dá)水平。

1.11Western印跡檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白質(zhì),用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,并將其轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。室溫條件下,將膜在5%脫脂乳中封閉2 h,然后,將膜與抗MMP-2(1∶1 000稀釋液)、MMP-9(1∶1 000稀釋液)、β-actin(1∶1 000稀釋液)的一抗在4 ℃孵育過夜。次日,將膜與二抗(1∶2 000稀釋度)在室溫下孵育2 h。分析各條帶灰度值。

1.12腫瘤異種移植 裸鼠實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物研究委員會(huì)批準(zhǔn)。將各組處理過后的細(xì)胞(1×107個(gè))皮下注射到 BALB/c 裸鼠中。每7天用卡尺測(cè)量腫瘤體積。注射35 d后處死所有小鼠,從所有裸鼠中分離腫瘤標(biāo)本用于進(jìn)一步分析。

1.13統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1紫草素對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響 與Con組比較,8、16、32、64 μmol/L紫草素顯著降低細(xì)胞OD值和克隆形成數(shù),且呈劑量依賴性(P<0.05)。以64 μmol/L紫草素進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。見表1。

表1 紫草素對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響

2.2紫草素對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與Con組比較,紫草素顯著降低細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)(P<0.05)。見表2、圖1、圖2。

1～6:Con組、紫草素組、miR-NC組、miR-214組、紫草素+anti-miR-NC組、紫草素+anti-miR-214組圖1 Western印跡檢測(cè)各組MMP-2、MMP-9蛋白

圖2 Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

表2 紫草素對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞miR-214表達(dá)及遷移和侵襲的影響

2.3紫草素對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞中miR-214表達(dá)的影響 與Con組比較,紫草素顯著升高miR-214表達(dá)水平(P<0.05)。見表2。

2.4miR-214過表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響 與miR-NC組比較,miR-214組miR-214表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),OD值和克隆形成數(shù)顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 miR-214過表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.5miR-214過表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較,miR-214組miR-214表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖1、圖2、表3。

2.6抑制miR-214表達(dá)逆轉(zhuǎn)了紫草素對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與紫草素+anti-miR-NC組比較,紫草素+anti-miR-214組miR-214表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),OD值和克隆形成數(shù)顯著升高(P<0.05),細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖1、圖2、表4。

表4 抑制miR-214表達(dá)逆轉(zhuǎn)了紫草素對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.7紫草素對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞體外移植瘤的影響 與Con組〔(1 002.00±4.16)/mm3〕比較,紫草素組腫瘤體積〔(586.67±3.48)/mm3〕顯著減小(P<0.05);與紫草素+anti-miR-NC組〔(580.00±4.73)/mm3〕比較,紫草素+anti-miR-214組腫瘤體積〔(839.67±2.33)mm3〕顯著變大(n=5,P<0.001)。見圖3。

1～4:Con組、紫草素組、紫草素+anti-miR-NC組、紫草素+anti-miR-214組圖3 各組35 d時(shí)Hela細(xì)胞體外移植瘤

3 討 論

紫草素來(lái)源于紫草科植物紫草的根。紫草素通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號(hào)通路可以抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)〔8〕。紫草素可以促進(jìn)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-9活化從而誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡〔9〕。二甲雙胍和紫草素可以抑制人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z增殖并促進(jìn)凋亡〔10〕。紫杉醇聯(lián)合紫草素對(duì)U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞有較好的抑制效果〔11〕。本實(shí)驗(yàn)研究表明,紫草素顯著降低宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲數(shù),對(duì)治療宮頸癌有較好的療效。Dan等〔12〕研究表明,β-羥基異戊基紫草素通過PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡。Wang等〔13〕研究表明,紫草素通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡和自噬。郝臻鳳〔14〕研究表明,紫草素通過調(diào)節(jié)小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物(ciRS-7)/miR-7/局部黏著斑激酶(FAK)軸抑制宮頸癌侵襲和遷移。楊陽(yáng)等〔15〕研究表明,紫草素影響宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖周期。于海榮等〔16〕研究表明,紫草素可以抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖。miR-214是一種非編碼小RNA,已有研究發(fā)現(xiàn),miR-214在多種腫瘤和癌癥中有表達(dá),并促進(jìn)或抑制了腫瘤和癌癥的發(fā)生發(fā)展。miR-214在甲狀腺乳頭狀癌患者的血清中高表達(dá),促進(jìn)了其增殖〔17〕。miR-214與腫瘤的關(guān)系密切〔18〕。miR-214通過靶向β-catenin通路抑制肝癌生長(zhǎng)〔19〕。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),miR-214在宮頸癌中高表達(dá)可以抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。已有研究宮頸癌的分子機(jī)制說明,miR-214對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞惡性表型的影響,可以抑制宮頸癌的生長(zhǎng)〔20〕。miR-214通過靶定GALNT7抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲〔21〕。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果說明,紫草素可以通過上調(diào)miR-214表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。有類似的報(bào)道,β-羥基異戊酰紫草素通過干預(yù)miR-10a-5p影響非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展〔22〕。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果說明,紫草素可以通過上調(diào)miR-214表達(dá)減小腫瘤體積。有研究顯示紫草素干預(yù)miR-130a-5p調(diào)節(jié)軸抑制乳腺癌侵襲遷移〔23〕。