談麗麗 魏雪梅 韓崇嶺 陳平

(青海省第五人民醫(yī)院眼科,青海 西寧 810000)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病(DM)的主要微血管并發(fā)癥之一,也是全球致盲的重要原因。研究表明,人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(hRECs)功能障礙是DR發(fā)展的初始事件,持續(xù)高糖刺激可增加活性氧的產(chǎn)生,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激增強(qiáng)和炎癥反應(yīng),損害血管屏障,導(dǎo)致hRECs損傷和凋亡〔1〕。因此,減輕hRECs損傷可能有助于臨床治療DR。木犀草素是一種在膳食植物、中草藥廣泛存在的天然黃酮類化合物,研究報(bào)道木犀草素預(yù)處理可激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶和抑制線粒體氧化應(yīng)從而激減輕糖尿病早期大鼠心肌缺血再灌注損傷,減輕高糖誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡〔2,3〕。木犀草素通過(guò)核因子相關(guān)因子2激活抗氧化蛋白表達(dá)還可減輕高糖誘導(dǎo)的腎臟系膜細(xì)胞損傷,延緩糖尿病腎病進(jìn)展〔4〕。此外,木犀草素通過(guò)上調(diào)miR-21表達(dá)保護(hù)PC-12細(xì)胞免受過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷〔5〕。然而,木犀草素是否對(duì)DR中hRECs損傷具有保護(hù)作用尚不清楚。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是非編碼RNA的重要成員,研究報(bào)道lncRNA通過(guò)染色質(zhì)修飾、表觀遺傳調(diào)控、miRNA調(diào)控等機(jī)制參與DR中多種病理過(guò)程,是DR診斷或預(yù)后的生物標(biāo)志物以和潛在的治療靶點(diǎn)〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病患者外周血及高糖誘導(dǎo)的人腎系膜細(xì)胞中l(wèi)ncRNA C-末端結(jié)合蛋白-1反義RNA2(CTBP1-AS2)表達(dá)下調(diào),過(guò)表達(dá)CTBP1-AS2可抑制高糖誘導(dǎo)的人腎系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞外基質(zhì)積累和炎癥反應(yīng)〔7〕。靶基因預(yù)測(cè)顯示miR-493-5p是CTBP1-AS2的潛在靶點(diǎn),既往研究證實(shí)抑制miR-493-5p表達(dá)可減輕高糖刺激誘導(dǎo)的成骨分化缺陷,緩解糖尿病小鼠的骨質(zhì)疏松情況〔8〕。然而,CTBP1-AS2是否靶向miR-493-5p參與DR中hRECs損傷并不清楚。本研究采用高糖誘導(dǎo)hRECs建立細(xì)胞損傷模型〔9〕,通過(guò)分析木犀草素對(duì)DR中hRECs凋亡、凋亡相關(guān)蛋白B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2和Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)表達(dá)及氧化應(yīng)激標(biāo)志物丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平的影響,旨在探討木犀草素的潛在保護(hù)作用,并探討其作用與CTBP1-AS2/miR-493-5p途徑的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 hRECs購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所;木犀草素(含量94.4%,111520-202006)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;miRNA熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程公司;PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于大連寶生生物公司;miRNA反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購(gòu)于廣州銳博生物公司;SYBR Green PCR Master Mix、膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin-Ⅴ-FITC)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物公司;MDA檢測(cè)試劑盒、SOD活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京百奧萊博生物公司;兔源Bcl-2多克隆抗體、羊抗兔IgG二抗、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、兔源Bax單克隆抗體購(gòu)自上海碧云天生物公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組 hRECs細(xì)胞接種含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含5.5 mmol/L葡萄糖)在97%濕度、37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液2次。當(dāng)細(xì)胞匯合度為80%時(shí)進(jìn)行胰酶消化和傳代,選擇第5代對(duì)數(shù)期hRECs用于實(shí)驗(yàn)。取2×105個(gè)hRECs接種6孔板,按照Lipofectamine2000使用說(shuō)明將pcDNA-CTBP1-AS2、pcDNA、si-CTBP1-AS2分別轉(zhuǎn)染hRECs,收集轉(zhuǎn)染48 h時(shí)hRECs。

實(shí)驗(yàn)分組:正常糖(NG)組:用含5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液處理48 h的hRECs;甘露醇組(MA):用含5.5 mmol/L葡萄糖和25.5 mmol/L甘露醇培養(yǎng)液處理48 h的hRECs;高糖組(HG)組:用含30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液處理48 h的hRECs〔9〕;HG+木犀草素低劑量組、HG+木犀草素中劑量組、HG+木犀草素高劑量組:采用含30 mmol/L葡萄糖和7.5或15.0或30.0 μmmol/L木犀草素〔3〕處理48 h的hRECs;HG+pcDNA組、HG+ pcDNA-CTBP1-AS2組:采用含30 mmol/L葡萄糖處理轉(zhuǎn)染pcDNA或pcDNA-CTBP1-AS2細(xì)胞48 h;HG+木犀草素+si-CTBP1-AS2組:采用含30 mmol/L葡萄糖和30.0 μmol/L木犀草素處理轉(zhuǎn)染si-CTBP1-AS2細(xì)胞48 h。

1.2.2實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)CTBP1-AS2和miR-493-5p表達(dá) 用TRIzol試劑提取各組hRECs總RNA,按照PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒或miRNA反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒合成cDNA,采用SYBR Green PCR Master Mix或miRNA熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)CTBP1-AS2或miR-493-5p表達(dá)。2-△△Ct法計(jì)算CTBP1-AS2(內(nèi)參為GAPDH)和miR-493-5p(內(nèi)參為U6)相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下:CTBP1-AS2上游5′-CACGTGTGGAGCCCTTGTAG-3′,下游5′-ACCAACCACATCGTCCCTTC-3′;GAPDH上游5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′;miR-493-5p上游5′-TTGTACATGGTAGGCTTTCATT-3′;U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCA-CGAATTTGCGT-3′。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hRECs凋亡率 胰蛋白酶處理各組hRECs,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞兩次,用1×結(jié)合緩沖液調(diào)整為2×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。向反應(yīng)管內(nèi)加入500 μl細(xì)胞懸液,依次加入Annexin-V-FITC、碘化丙啶各5 μl置于暗室內(nèi)孵育細(xì)胞15 min。1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例。

1.2.4Western印跡檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 向各組hRECs中加入RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度合格后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。隨后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜,室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h。隨后將膜與Bax、Bcl-2、GAPDH一抗溶液4 ℃孵育過(guò)夜。Tween-20-Tris緩沖鹽水(TBST)洗膜3次,用對(duì)應(yīng)的二抗溶液室溫下孵育膜1 h。最后將膜置于塑料盒,滴加化學(xué)發(fā)光試劑置于黑暗環(huán)境下顯影、定影。Image-Pro Plus6.0軟件分析各條帶灰度值,以目的蛋白和內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示對(duì)應(yīng)蛋白表達(dá)量。

1.2.5試劑盒檢測(cè)hRECs中MDA水平和SOD活性 收集各組hRECs至離心管,加入提取液超聲破碎細(xì)胞,獲得細(xì)胞上清液。按照試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書(shū)分析各組hRECs中MDA水平和SOD活性。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 根據(jù)starbase預(yù)測(cè)到的CTBP1-AS2與miR-493-5p之間的結(jié)合位點(diǎn),合成含有miR-493-5p結(jié)合位點(diǎn)的CTBP1-AS2野生型(WT)序列,同時(shí)合成不含miR-493-5p結(jié)合位點(diǎn)CTBP1-AS2突變型(MUT)序列,分別將上述序列克隆到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3以構(gòu)建WT重組熒光素酶報(bào)告載體WT-circ_0010729和WT重組熒光素酶報(bào)告載體MUT-circ_0010729。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-493-5p mimics、miR-NC分別與上述報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染hRECs,采用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒分析轉(zhuǎn)染48 h后hRECs的相對(duì)熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1木犀草素對(duì)高糖誘導(dǎo)的hRECs凋亡的影響 與NG組比較,HG組hRECs中CTBP1-AS2表達(dá)量、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低,miR-493-5p表達(dá)量、Bax蛋白表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與HG組比較,HG+木犀草素低劑量組、HG+木犀草素中劑量組、HG+木犀草素高劑量組hRECs中CTBP1-AS2表達(dá)量、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高,miR-493-5p表達(dá)量、Bax蛋白表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。HG+木犀草素低劑量組、HG+木犀草素中劑量組、HG+木犀草素高劑量組3組間上述指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1、表1、圖2。

表1 木犀草素對(duì)高糖誘導(dǎo)的hRECs凋亡及氧化應(yīng)激的影響

圖1 木犀草素對(duì)高糖誘導(dǎo)的hRECs凋亡的影響

1～6:NG組、MA組、HG組、HG+木犀草素低劑量組、HG+木犀草素中劑量組、HG+木犀草素高劑量組圖2 Western印跡檢測(cè)各組Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

2.2木犀草素對(duì)高糖誘導(dǎo)的hRECs氧化應(yīng)激的影響 與NG組比較,MA組hRECs中SOD活性、MDA含量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這可排除高滲對(duì)hRECs氧化應(yīng)激的影響。與NG組比較,HG組hRECs中SOD活性顯著降低,MDA含量顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與HG組比較,HG+木犀草素低劑量組、HG+木犀草素中劑量組、HG+木犀草素高劑量組hRECs中SOD活性顯著升高,MDA含量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。HG+木犀草素低劑量組、HG+木犀草素中劑量組、HG+木犀草素高劑量組3組間上述指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3過(guò)表達(dá)CTBP1-AS2對(duì)高糖誘導(dǎo)的hRECs凋亡及氧化應(yīng)激的影響 與HG組、HG+pcDNA組比較,HG+pcDNA-CTBP1-AS2組hRECs中CTBP1-AS2表達(dá)量,Bcl-2蛋白表達(dá)量、SOD活性顯著升高,miR-493-5p表達(dá)量、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量、MDA含量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表2、圖3。

表2 CTBP1-AS2對(duì)高糖誘導(dǎo)的hRECs凋亡及氧化應(yīng)激的影響

1～3:HG組、HG+pcDNA組、HG+pcDNA-CTBP1-AS2組

2.4CTBP1-AS2靶向miR-493-5p Starbase預(yù)測(cè)到miR-493-5p與CTBP1-AS2序列間存在特異結(jié)合靶點(diǎn),見(jiàn)圖4。熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染miR-NC(1.00±0.09)比較,轉(zhuǎn)染miR-493-5p mimics后hRECs中WT-CTBP1-AS2的相對(duì)熒光素酶活性明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.41±0.05,P<0.01),而MUT-CTBP1-AS2的相對(duì)熒光素酶活性變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.98±0.07 vs 0.95±0.10,P>0.05)。

圖4 CTBP1-AS2和miR-493-5p的互補(bǔ)序列

2.5抑制CTBP1-AS2逆轉(zhuǎn)木犀草素對(duì)高糖誘導(dǎo)的hRECs凋亡的影響 與HG組比較,HG+木犀草素組hRECs中CTBP1-AS2表達(dá)量、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高,凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量、miR-493-5p表達(dá)量顯著降低(均P<0.05);與HG+木犀草素組比較,HG+木犀草素+si-CTBP1-AS2組hRECs中CTBP1-AS2表達(dá)量、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低,凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量、miR-493-5p表達(dá)量顯著升高(均P<0.05)。見(jiàn)圖5、表3。

表3 抑制CTBP1-AS2對(duì)逆轉(zhuǎn)木犀草素對(duì)高糖誘導(dǎo)的hRECs凋亡及氧化應(yīng)激損傷的影響

1～2:HG組、HG+木犀草素組、HG+木犀草素+si-CTBP1-AS2組

2.6抑制CTBP1-AS2逆轉(zhuǎn)木犀草素對(duì)高糖誘導(dǎo)的hRECs氧化應(yīng)激損傷的影響 與HG組比較,HG+木犀草素組hRECs中SOD活性顯著升高,MDA含量顯著降低(P<0.05);與HG+木犀草素組比較,HG+木犀草素+si-CTBP1-AS2組hRECs中SOD活性顯著降低,MDA含量顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

3 討 論

近年研究表明,木犀草素具有廣的細(xì)胞保護(hù)作用。Hong等〔10〕研究表明,在大鼠腎缺血再灌注損傷過(guò)程中,木犀草素降低缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥反應(yīng)、腎細(xì)胞凋亡改善腎功能障礙和組織學(xué)損傷。Chen等〔11〕指出,木犀草素可提高過(guò)氧化氫作用下皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的活力,提高抗氧化酶的表達(dá),保護(hù)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞免受ROS誘導(dǎo)的損傷。Yu等〔12〕證實(shí),木犀草素可抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLRP)3炎癥小體形成,抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡,對(duì)糖尿病腎病具有潛在治療作用。糖尿病中過(guò)量活性氧的產(chǎn)生可氧化細(xì)胞蛋白、膜脂和核酸,加重hRECs受損,SOD是清除氧自由基的內(nèi)源性抗氧化劑,其水平是機(jī)體氧化應(yīng)激水平的陰性標(biāo)志物〔13〕。本研究結(jié)果表明,木犀草素通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力,抑制凋亡,進(jìn)而保護(hù)hRECs免受高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

lncRNA是缺乏蛋白編碼潛能的RNA轉(zhuǎn)錄本,其通過(guò)吸附miRNA間接影響miRNA靶mRNA的穩(wěn)定性和翻譯能力從而影響多種人類疾病進(jìn)展,例如lncRNA H19可靶向miR-93上調(diào)xbp1表達(dá)進(jìn)而抑制高血糖下視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)〔14〕。已有研究證實(shí),木犀草素通過(guò)下調(diào)致癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(BANCR)激活lncRNA(lnc-BANCR)表達(dá)抑制下游促甲狀腺激素受體/細(xì)胞周期蛋白D1基因信號(hào)通路進(jìn)而誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞G0/G1期阻滯,抑制細(xì)胞增殖〔15〕。木犀草素可抑制脂多糖誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞活力喪失、細(xì)胞凋亡和炎癥因子的表達(dá),其機(jī)制與抑制miR-132表達(dá)有關(guān)〔16〕。本研究提示,木犀草素對(duì)高糖誘導(dǎo)的hRECs損傷的保護(hù)作用可能與調(diào)控CTBP1-AS2和miR-493-5p表達(dá)相關(guān)。目前關(guān)于CTBP1-AS2研究多集中在癌癥中,研究表明CTBP1-AS2在宮頸癌、肝癌、胃癌中表達(dá)增加,參與癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和耐藥,具有致癌因子作用〔17～19〕。此外,有報(bào)道稱lncRNA CTBP1-AS2可能通過(guò)抑制氧化低密度脂蛋白處理后血管平滑肌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其自噬進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展〔20〕。本研究表明,過(guò)表達(dá)CTBP1-AS2顯著減弱高糖刺激對(duì)hRECs細(xì)胞SOD活性、MDA水平、細(xì)胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響,保護(hù)hRECs免受高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷和凋亡,這與木犀草素對(duì)高糖誘導(dǎo)的hRECs的保護(hù)效果一致。進(jìn)一步研究證實(shí),CTBP1-AS2與miR-493-5p存在直接作用,過(guò)表達(dá)CTBP1-AS2可減弱高糖刺激對(duì)miR-493-5p表達(dá)的誘導(dǎo)作用,這表明在高糖誘導(dǎo)的hRECs中可能存在CTBP1-AS2/miR-493-5p調(diào)控途徑。本研究結(jié)果表明,抑制CTBP1-AS2表達(dá)顯著削弱木犀草素處理對(duì)高糖誘導(dǎo)的hRECs凋亡和氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用,表明木犀草素可能通過(guò)上調(diào)CTBP1-AS2/miR-493-5p途徑進(jìn)而對(duì)高糖誘導(dǎo)的hRECs損傷發(fā)揮保護(hù)作用。然而,本研究存在一定的局限性,木犀草素下游是否存在其他lncRNA/miRNA調(diào)控途徑、miRNA的下游可能靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步確認(rèn)。

綜上所述,木犀草素可有效抑制高糖誘導(dǎo)的hRECs凋亡和氧化應(yīng)激損傷,其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)CTBP1-AS2/miR-493-5p途徑實(shí)現(xiàn)的,這首次揭示了木犀草素在高糖誘導(dǎo)的hRECs損傷中的保護(hù)作用和分子機(jī)制。