黃長智 林久灶 黃聿峰 黃兆曦 柯銘鋒 陳挺霖

(寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院骨科,福建 寧德 352000)

骨質(zhì)疏松是指以骨小梁減少、骨質(zhì)改變及骨脆性增加為表現(xiàn)的疾病,多發(fā)于老年人群,隨著我國人口老齡化的加劇,老年骨質(zhì)疏松的發(fā)病率逐漸升高,報道稱〔1〕,因骨質(zhì)疏松所致的骨折和骨缺損是目前急需解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)〔2,3〕,脂肪干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類似,均具有多向分化潛能,其可作為種子細(xì)胞用于骨質(zhì)疏松的治療。長鏈非編碼RNA(lncRNA)屬于一類非編碼RNA,其參與多種生物進(jìn)程,如干細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖及包括骨質(zhì)疏松在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生進(jìn)展,研究認(rèn)為〔4〕,在成骨分化過程中,lncRNA具有促進(jìn)或抑制干細(xì)胞成骨分化的作用。lncRNA H19屬于lncRNA成員,其位于11號染色體上,研究顯示〔5〕,其對干細(xì)胞成骨分化具有正向促進(jìn)作用。張傳志等〔6〕在其研究中認(rèn)為,lncRNA H19參與骨質(zhì)疏松的發(fā)生和進(jìn)展。本研究為了更好地促進(jìn)骨質(zhì)疏松老齡大鼠脂肪干細(xì)胞成骨分化,做lncRNA H19轉(zhuǎn)染處理,分析轉(zhuǎn)染lncRNA H19對脂肪干細(xì)胞成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物:選取18～20月齡老齡大鼠10只,購自廣州國家實(shí)驗(yàn)室〔動物許可證號SYXK(粵)2022-0285〕,體質(zhì)量為500～700 g,均常規(guī)分籠飼適應(yīng)喂養(yǎng)7 d,自由進(jìn)食、飲水,室溫控制在21～25 ℃,相對濕度控制在45%～50%,光暗交替周期為12 h。操作均符合動物實(shí)驗(yàn)倫理要求。主要試劑及儀器:維甲酸(深圳振強(qiáng)生物技術(shù)有限公司);lncRNA H19 siRNA慢病毒載體、空載體(上海吉瑪);茜素紅染色液、堿性磷酸酶(ALP)活性檢測試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司);骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、Smad1、Smad2抗體(深圳海思安生物技術(shù)有限公司)。流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特);倒置顯微鏡(美國BD)。

1.2骨質(zhì)疏松模型構(gòu)建 10只大鼠中5只作為空白組,正常喂養(yǎng),另外5只每日使用70 mg/kg灌胃構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型,14 d后觀察大鼠骨密度、股骨近端組織病理變化。

1.3骨質(zhì)疏松老齡大鼠脂肪干細(xì)胞分離、培養(yǎng) 將骨質(zhì)疏松大鼠處死后,沿腹股溝處切開皮膚,暴露皮下脂肪,去除筋膜組織后,取脂肪組織,將其剪碎后常規(guī)培養(yǎng),接種于培養(yǎng)瓶內(nèi),在DMEM培養(yǎng)液內(nèi)脂肪原代干細(xì)胞,待細(xì)胞長滿至培養(yǎng)瓶底75%～80%時使用酶消化法行1∶3傳代,傳至第三代備用。使用流式細(xì)胞儀測定第3代脂肪干細(xì)胞免疫表型。

1.4lncRNA H19轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率鑒定 將所制備的脂肪干細(xì)胞分為3組,即不做任何處理僅做細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)的對照組、轉(zhuǎn)染lncRNA H19空載體的空載組、轉(zhuǎn)染lncRNA H19 siRNA慢病毒載體的H19 siRNA組。48 h后做后續(xù)指標(biāo)觀察。

使用實(shí)時熒光定量PCR法測定lncRNA H19轉(zhuǎn)染效率,提取并測定細(xì)胞RNA純度,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,以cDNA為模板,做PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系:0.4 μl lncRNA H19上游引物、0.4 μl lncRNA H19下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl SYB Green,加蒸餾水至20 μl。擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min,72 ℃延伸5 min,40個循環(huán),采用2-ΔΔCt方法計算lncRNA H19表達(dá)量。lncRNA H19上游引物:5′-GCCTGAGTCTCTCCGTATGG-3′,下游:5′-GAAGGAAGGTGCGTTGAACA-3′;內(nèi)參β-actin上游引物:5′-TCTCTGGTCCTGGGTCTTGT-3′,下游:5′-ATGGCTTGTCAAGGCAGTTTC-3′。

1.5脂肪干細(xì)胞成骨分化能力測定 以5×104個/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板上,固定后磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,加入2%茜素紅1 ml,避光30 min后對細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成情況進(jìn)行觀察,結(jié)節(jié)越多成骨能力越強(qiáng)。

1.6脂肪干細(xì)胞ALP染色和活性測定 以5×104個/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板上,24 h后使用40 g/L多聚甲醛固定,培養(yǎng)皿底部使用One-StepTMNBT/BCIP溶液完全覆蓋后在室溫、避光環(huán)境下孵育1 h,使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞ALP染色情況,同時使用ALP試劑盒測定ALP活性。

1.7成骨基因測定 使用實(shí)時熒光定量PCR法測定成骨基因RUNX2、OPN、OCN表達(dá)量,方法同1.4。RUNX2上游引物:5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′,下游:5′-GGCAGCTTCCCAGGGGTAA-3′;OPN上游引物:5′-CACCGAGACAGGATCAGAGG-3′,下游:5′-CTTTGGGACACAAGCCCGTGC-3′;OPN上游引物:5′-ACTTGCAGCGAGGTAGTGAAGA-3′,下游:5′-AACTCGTCAAGGTCCGGATTG-3′。

1.8BMPs/TGF-β信號通路蛋白測定 將脂肪干細(xì)胞裂解后提取蛋白,二喹啉甲酸(BCA)測定蛋白濃度,之后經(jīng)蛋白與緩沖液以4∶1的比例混合均勻后煮沸使其變性,加脫脂奶粉,置于聚偏氟乙烯膜上,加1∶2 000稀釋的一抗(BMP-2、TGF-β、Smad1、Smad2),孵育過夜。第2天使用Tris-HCl緩沖鹽溶液清洗,加入二抗,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影,定影,獲得目標(biāo)蛋白表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1骨質(zhì)疏松模型驗(yàn)證 骨質(zhì)疏松組骨密度較空白組明顯降低(P<0.05)。見表1。HE染色顯示,空白組骨組織形態(tài)完整,骨小梁排列整齊,結(jié)構(gòu)飽滿,骨質(zhì)疏松組骨小梁數(shù)量減少,排列不齊,斷裂,間隙增寬。見圖1。說明骨質(zhì)疏松模型建立成功。

圖1 兩組股骨近端骨組織病理(HE染色,×200)

表1 空白組、骨質(zhì)疏松組骨密度比較

2.2骨質(zhì)疏松老齡大鼠脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定 鏡下觀察顯示,骨質(zhì)疏松老齡大鼠第三代脂肪干細(xì)胞多為長梭形、多角形,見圖2。脂肪干細(xì)胞表面抗原CD73、CD90等陽性標(biāo)志物表達(dá)較高,分別為99.80%、100.00%,CD34、CD45等陰性標(biāo)志物表達(dá)較低,分別為0.23%、0.80%,提示所培養(yǎng)的細(xì)胞為脂肪來源干細(xì)胞。

圖2 第三代脂肪干細(xì)胞鏡下形態(tài)

2.3lncRNA H19轉(zhuǎn)染效率鑒定 H19 siRNA組lncRNA H19表達(dá)量明顯低于對照組、空載組(P<0.05),對照組、空載組比較無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 lncRNA H19轉(zhuǎn)染效率及l(fā)ncRNA H19對脂肪干細(xì)胞ALP活性的影響

2.4lncRNA H19對脂肪干細(xì)胞ALP活性的影響 H19 siRNA組ALP活性明顯高于對照組、空載組(P<0.05)。見表2、圖3。

圖3 各組ALP活性(NBT/BCIP染色,×100)

2.5lncRNA H19對脂肪干細(xì)胞成骨分化能力的影響 H19 siRNA組礦化結(jié)節(jié)較多,顏色為深紅,對照組、空載組僅有少量礦化結(jié)節(jié),說明H19 siRNA組成骨分化能力較對照組、空白組增強(qiáng)。見圖4。

圖4 3組脂肪干細(xì)胞成骨分化能力(茜素紅染色,×100)

2.6lncRNA H19對脂肪干細(xì)胞成骨基因的影響 H19 siRNA組成骨基因RUNX2、OPN、OCN表達(dá)量明顯高于對照組、空載組(P<0.05)。見表3。

表3 lncRNA H19對脂肪干細(xì)胞成骨相關(guān)基因的影響

2.7lncRNA H19對脂肪干細(xì)胞BMPs/TGF-β信號通路蛋白表達(dá)的影響 H19 siRNA組BMPs/TGF-β信號通路蛋白BMP-2、TGF-β、Smad1、Smad2表達(dá)量均明顯高于對照組、空載組(P<0.05)。見表4、圖5。

圖5 3組BMPs/TGF-β信號通路蛋白表達(dá)

表4 lncRNA H19對脂肪干細(xì)胞BMPs/TGF-β信號通路蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

骨質(zhì)疏松發(fā)病率隨著年齡的增加而增加,究其原因可能與隨著年齡的增長,人體骨骼中骨質(zhì)改變導(dǎo)致骨密度降低有關(guān),而此病的發(fā)生本質(zhì)為成骨和破骨細(xì)胞失衡〔7〕。近年來隨著臨床上對干細(xì)胞的逐漸研究發(fā)現(xiàn)〔8,9〕,干細(xì)胞具有較強(qiáng)的成骨分化作用,在移植后可抑制成骨和破骨細(xì)胞失衡,促進(jìn)兩者平衡,進(jìn)而增加骨密度,在骨質(zhì)疏松的治療中具有較高的價值。有報道顯示〔10,11〕,骨質(zhì)疏松的發(fā)生涉及多個機(jī)制,lncRNA屬長鏈非編RNA,主要分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)內(nèi),其結(jié)構(gòu)和來源與微小RNA類似,均是由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄所得,通常情況下,lncRNA在RNA水平上可經(jīng)調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的表達(dá)而發(fā)揮作用。lncRNA H19具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生進(jìn)展、細(xì)胞分化、胚胎生長的作用〔12,13〕。研究發(fā)現(xiàn)〔14〕,在骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中l(wèi)ncRNA H19可經(jīng)影響成骨/破骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與骨代謝過程,其在骨質(zhì)疏松中表達(dá)降低。Li等〔15〕在其報道中認(rèn)為,在骨質(zhì)疏松中l(wèi)ncRNA H19上調(diào)可促進(jìn)炎癥因子的過度表達(dá),抑制成骨細(xì)胞增殖。

目前有關(guān)lncRNA H19的研究主要以對干細(xì)胞成骨分化和成脂分化為主,在骨質(zhì)疏松中其可經(jīng)作用于微小RNA-532-3p/沉默信息調(diào)節(jié)因子1信號通路誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化〔16〕。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),lncRNA H19可經(jīng)調(diào)控成骨相關(guān)蛋白BMP-2的表達(dá)而增強(qiáng)干細(xì)胞成骨分化能力〔17〕。Zhong等〔18〕報道顯示,lncRNA H19通過調(diào)控miR-140-5p和BMP-2/FGF9促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)細(xì)胞分化。上述報道均證實(shí),lncRNA H19具有促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化的作用,但有關(guān)lncRNA H19對骨質(zhì)疏松來源脂肪干細(xì)胞成骨分化的報道較少,本研究結(jié)果說明,lncRNA H19具有促骨質(zhì)疏松來源脂肪干細(xì)胞成骨分化的作用。

ALP在成骨誘導(dǎo)過程中最先反應(yīng),在成骨分化開始時ALP活性增加,隨著成骨分化能力的增強(qiáng),其活性逐漸增加,其活性高低與成骨分化能力正相關(guān)〔19,20〕。RUNX2可影響骨/成骨細(xì)胞分化、成骨基因表達(dá)和骨形成,臨床上多根據(jù)其水平評估成骨能力〔21,22〕。OPN、OCN分別均由骨質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生,參與骨吸收、骨改變,兩者水平可直接反映出骨形成狀態(tài)〔23〕。本研究結(jié)果說明,lncRNA H19具有促進(jìn)脂肪干細(xì)胞成骨分化的能力。

本研究結(jié)果說明,BMPs/TGF-β可能是lncRNA H19促進(jìn)脂肪干細(xì)胞成骨分化的作用途徑。研究表明,BMPs/TGF-β信號通路中BMP-2、TGF-β為信號傳遞分子,其中BMP-2屬于一種酸性糖蛋白,其主要來源于骨相關(guān)結(jié)締組織和軟骨組織,可促新骨形成〔24,25〕。TGF-β主要來源于骨基質(zhì),其參與機(jī)體骨代謝穩(wěn)定和骨架維護(hù)〔26〕。研究發(fā)現(xiàn)〔27,28〕,TGF-β在發(fā)揮作用的過程中作用于特定配體的受體復(fù)合物Smads發(fā)揮作用,在上述作用下,Smads被激活,進(jìn)而影響下游靶基因轉(zhuǎn)錄,增加ALP活性,促進(jìn)成骨分化。另外BMPs/TGF-β信號通路分子BMP-2、TGF-β經(jīng)共同作用于四聚體受體復(fù)合體,可同時向典型和非典型的Smads傳遞信號,進(jìn)而影響成骨細(xì)胞分化、骨形成和骨穩(wěn)態(tài)〔29〕。本研究發(fā)現(xiàn),lncRNA H19在骨質(zhì)疏松中可能經(jīng)BMPs/TGF-β途徑促進(jìn)脂肪干細(xì)胞成骨分化。

雖然本研究認(rèn)為lncRNA H19可能經(jīng)BMPs/TGF-β途徑促進(jìn)RUNX2、OPN、OCN等成骨基因表達(dá)而發(fā)揮促骨質(zhì)疏松老齡大鼠脂肪干細(xì)胞成骨分化的作用,但本研究并未進(jìn)一步分析lncRNA H19與BMP-2、TGF-β的靶向關(guān)系,且目前臨床上有關(guān)此類的研究較少,因此還需后續(xù)研究進(jìn)一步深入探討。