田中青 李金洲 曹丕健

(1菏澤市中醫(yī)醫(yī)院骨科,山東 菏澤 274000;2菏澤市巨野縣人民醫(yī)院骨科;3菏澤市牡丹人民醫(yī)院骨科)

骨質(zhì)疏松是一種骨量減少,微結(jié)構(gòu)退化和脆性骨折的疾病,好發(fā)于老年人和絕經(jīng)后婦女;促進(jìn)骨形成是預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的方式之一〔1,2〕。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是骨髓中具有較強(qiáng)的增殖能力和多向分化的潛能干細(xì)胞,分化失衡是引發(fā)骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵,促進(jìn)其向成骨方向分化可防治骨質(zhì)疏松;因此,尋找決定BMSCs分化方向的關(guān)鍵因子,可為骨質(zhì)疏松的治療提供新思路〔3〕。研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)能調(diào)控成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和BMSCs進(jìn)而影響骨代謝進(jìn)程,lncRNA表達(dá)失調(diào)與關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松和骨癌等多種骨疾病密切相關(guān),有望作為預(yù)測(cè)骨疾病的生物標(biāo)志物〔4〕。研究報(bào)道LINC00334在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松腎陰虛證中上調(diào)表達(dá),其可能參與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松腎陰虛證的發(fā)生發(fā)展過程〔5〕。而LINC00334對(duì)BMSCs增殖、凋亡及成骨分化的影響尚不清楚。

研究報(bào)道ras同源家族(Rho)A/Rho激酶(ROCK)信號(hào)通路在骨質(zhì)疏松BMSCs中表達(dá)降低,可能是骨質(zhì)疏松發(fā)病的重要原因之一〔6〕。激活RhoA/ROCK信號(hào)通路可促進(jìn)成骨分化和BMSCs增殖〔7〕。地塞米松(Dex)是糖皮質(zhì)類激素,研究顯示較低濃度的Dex抑制BMSCs增殖及成骨分化,從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生〔8〕。本實(shí)驗(yàn)用Dex處理BMSCs,研究LINC00334對(duì)Dex處理BMSCs增殖、凋亡和成骨分化的影響及其可能的作用機(jī)制是否與RhoA/ROCK信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠BMSCs購(gòu)自上海博湖生物科技有限公司;α-MEM培養(yǎng)基、青鏈霉素、Dex購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;RhoA/ROCK信號(hào)通路抑制劑Y27632購(gòu)自深圳欣博盛生物科技有限公司;Trizol試劑購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司;SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購(gòu)自武漢科昊佳生物科技有限公司;四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒購(gòu)自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司;放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)公司。

1.2細(xì)胞處理與分組 BMSCs細(xì)胞用含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng),用10-6mol/L Dex處理BMSCs作為骨質(zhì)疏松模型組,正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組;將si-NC、si-LINC00334轉(zhuǎn)染至BMSCs后用10-6mol/L Dex處理,記為模型+si-NC組、模型+si-LINC00334組;將si-LINC00334轉(zhuǎn)染至BMSCs后用10-6mol/L Dex和RhoA/ROCK信號(hào)通路抑制劑Y27632處理,記為模型+si-LINC00334+抑制劑組。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)LINC00334、骨橋蛋白(OPN)mRNA、Run相關(guān)基因(Runx)2 mRNA、RhoA mRNA和ROCK mRNA表達(dá)水平 收集細(xì)胞提取總RNA,合成cDNA,按照試劑盒說明進(jìn)行PCR,相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。以GAPDH為內(nèi)參,LINC00334上游引物:5′-CGTGGGTTCTCCTTTGAGAG-3′,下游:5′-GGAAGCCCA-ATACATCCAAA-3′;OPN上游引物:5′-ACCCTTCCAAGTAAGTCC-3′,下游:5′-TGATGTCCTCGTCTGTAG-3′;Runx2上游引物:5′-CCGGTCTCCTTCCA-GGAT-3′,下游:5′-GGGAACTGCTGTGGCTTC-3′;RhoA上游引物:5′-TGATGGCTATTATGGACG-3′,下游:5′-GGAAGGCACAAATGAGAT-3′;ROCK上游引物:5′-CTGCGGGTACGAAGGTATCG-3′,下游:5′-AGCATCCAATCCATCCAGCA-3′;GAPDH上游引物:5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′,下游:5′-CTCCACGAC-GTACTCAGCG-3′。

1.4MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 收集培養(yǎng)48 h的各組細(xì)胞,按試劑盒說明進(jìn)行,每孔分別加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl,于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl,振蕩反應(yīng)10 min使沉淀溶解,用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(OD)值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=1-OD實(shí)驗(yàn)組值/OD空白對(duì)照組值×100%。

1.5克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成數(shù) 各組細(xì)胞消化后接種于6孔板,每孔100個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)2 w出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)終止培養(yǎng),磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍,甲醇固定15 min,吉姆薩染色30 min,然后計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.6Western印跡檢測(cè)Ki67、裂解的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase)3、caspase3前體(Pro-caspase3)蛋白表達(dá)提取總蛋白,BCA試劑盒定量后進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜、封閉后加入一抗4 ℃孵育過夜,然后再加入二抗室溫孵育2 h,最后加入電化學(xué)發(fā)光液(ECL)顯影,檢測(cè)蛋白條帶灰度值,計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集培養(yǎng)48 h的各組細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS漂洗2次,加入500 μl的結(jié)合緩沖液重懸,加入10 μl的Annexin V-FITC,再加入5 μl的PI,混勻后避光孵育10 min;然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1干擾LINC00334對(duì)Dex處理的BMSCs增殖的影響 與對(duì)照組相比,模型組和模型+si-NC組LINC00334表達(dá)水平明顯升高(t=41.590、41.723,P<0.05),細(xì)胞增殖抑制率明顯升高(t=46.538、46.867,P<0.05),克隆形成數(shù)明顯減少(t=25.899、25.756,P<0.05),Ki67表達(dá)水平明顯降低(t=26.112、26.112,P<0.05);與模型組和模型+si-NC組相比,模型+si-LINC00334組LINC00334表達(dá)水平顯著降低(t=27.550、27.683,P<0.05),細(xì)胞增殖抑制率顯著降低(t=26.793、27.123,P<0.05),克隆形成數(shù)明顯升高(t=14.676、14.533,P<0.05),Ki67表達(dá)水平明顯升高(t=17.234、17.234,P<0.05),見表1、圖1。

1～4:對(duì)照組,模型組,模型+si-NC組,模型+si-LINC00334組,圖3同圖1 干擾LINC00334對(duì)Dex處理的BMSCs中Ki67蛋白表達(dá)的影響

表1 干擾LINC00334對(duì)Dex處理的BMSCs增殖的影響

2.2干擾LINC00334對(duì)Dex處理的BMSCs凋亡的影響與對(duì)照組相比,模型組和模型+si-NC組細(xì)胞凋亡率明顯升高(t=40.498、40.525,均P<0.05),Cleaved-caspase3表達(dá)水平明顯升高(t=18.783、18.783,均P<0.05),Pro-caspase3表達(dá)水平明顯降低(t=23.515、23.515,均P<0.05);與模型組和模型+si-NC組相比,模型+si-LINC00334組細(xì)胞凋亡率明顯降低(t=21.424、21.451,均P<0.05),Cleaved-caspase3表達(dá)水平明顯降低(t=17.709、17.709,均P<0.05),Pro-caspase3表達(dá)水平明顯升高(t=20.785、20.785,均P<0.05),見表2、圖2、圖3。

圖2 干擾LINC00334對(duì)Dex處理的BMSCs凋亡率的影響

1～4:對(duì)照組、模型組、模型+si-NC組、模型+si-LINC00334組圖3 干擾LINC00334對(duì)Dex處理的BMSCs中caspase3蛋白表達(dá)的影響

表2 干擾LINC00334對(duì)Dex處理的BMSCs凋亡、OPN、Runx2 mRNA及RhoA/ROCK信號(hào)通路的影響

2.3干擾LINC00334對(duì)Dex處理的BMSCs中OPN、Runx2 mRNA的影響 與對(duì)照組相比,模型組和模型+si-NC組OPN和Runx2 mRNA表達(dá)水平明顯降低(t=13.175、13.760、18.142、18.520,均P<0.05);與模型組和模型+si-NC組相比,模型+si-LINC00334組OPN和Runx2 mRNA表達(dá)水平明顯升高(t=8.490、9.076、10.961、11.339,均P<0.05),見表2。

2.4干擾LINC00334對(duì)Dex處理的BMSCs中RhoA/ROCK信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組相比,模型組和模型+si-NC組RhoA和ROCK mRNA表達(dá)水平明顯降低(t=26.944、26.595、20.502、19.932,均P<0.05);與模型組和模型+si-NC組相比,模型+si-LINC00334組RhoA mRNA和ROCK mRNA表達(dá)水平明顯升高(t=19.246、18.896、15.376、14.807,均P<0.05),見表2。

2.5RhoA/ROCK抑制劑能減輕干擾LINC00334對(duì)Dex處理的BMSCs增殖凋亡的影響 與模型+si-LINC00334組相比,模型+si-LINC00334+抑制劑組細(xì)胞增殖抑制率明顯升高,克隆形成數(shù)明顯減少,Ki67表達(dá)水平明顯降低,細(xì)胞凋亡率明顯升高,Cleaved-caspase3表達(dá)水平明顯升高,Pro-caspase3表達(dá)水平明顯降低,OPN和Runx2 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01,P<0.001),見表3、圖4、圖5。

圖4 RhoA/ROCK抑制劑能減輕干擾LINC00334對(duì)Dex處理的BMSCs凋亡率的影響

1,2:模型+si-LINC00334組,模型+si-LINC00334+抑制劑組圖5 RhoA/ROCK抑制劑能減輕干擾LINC00334對(duì)Dex處理的BMSCs中Ki67和caspase3蛋白表達(dá)的影響

表3 RhoA/ROCK抑制劑能減輕干擾LINC00334對(duì)Dex處理的BMSCs增殖凋亡的影響

3 討 論

BMSCs的分化失衡是引發(fā)骨質(zhì)疏松的重要因素之一。Dex是常用的凋亡誘導(dǎo)劑,研究發(fā)現(xiàn)10-6mol/L的Dex抑制BMSCs增殖〔9〕。本實(shí)驗(yàn)用結(jié)果顯示,10-6mol/L的Dex可抑制BMSCs增殖和成骨分化,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,表明模型建立成功。有研究表明lncRNA參與BMSCs的成骨分化和成脂分化〔10〕。如lncRNA AK045490沉默可通過β-catenin/ T細(xì)胞因子(TCF)1/Runx2信號(hào)軸促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨形成〔11〕。抑制lncRNA HOTAIR可促進(jìn)大鼠BMSCs的成骨細(xì)胞分化〔12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,LINC00334或可作為骨質(zhì)疏松癥中的生物標(biāo)志物。OPN、Runx2是成骨分化關(guān)鍵因子,其高表達(dá)促進(jìn)成骨分化〔13,14〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,干擾LINC00334可促進(jìn)BMSCs增殖和成骨分化,抑制Dex處理的BMSCs凋亡。但LINC00334影響B(tài)MSCs增殖、凋亡和成骨分化的機(jī)制尚不清楚。研究表明RhoA/ROCK信號(hào)通路可能通過介導(dǎo)細(xì)胞骨架變形來(lái)促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化〔15〕。二甲基草酰甘氨酸通過Rho/ROCK信號(hào)促進(jìn)BMSCs成骨〔16〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,干擾LINC00334可能通過調(diào)控RhoA/ROCK信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs增殖和成骨分化,抑制Dex誘導(dǎo)的BMSCs凋亡。

成骨細(xì)胞功能衰減,骨形成不足,最終導(dǎo)致骨量丟失是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松產(chǎn)生的重要原因,而成骨不足與BMSCs分化方向密切相關(guān)〔17〕。因此,促進(jìn)BMSCs向成骨方向分化是防治骨質(zhì)疏松的重要途徑之一。本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新在于LINC00334是首次在BMSCs增殖、凋亡和成骨分化等方面的研究,且表明了其機(jī)制與RhoA/ROCK信號(hào)通路可能有關(guān)。盡管本實(shí)驗(yàn)證明了干擾LINC00334可能通過調(diào)控RhoA/ROCK信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs增殖和成骨分化,抑制Dex誘導(dǎo)的BMSCs凋亡。但本實(shí)驗(yàn)主要在細(xì)胞中進(jìn)行的研究,其是否在體內(nèi)起同樣作用還有待進(jìn)一步的研究。