楊華軍 何金英 孫博文 王廣 林江 李云飛

(1遵義市第一人民醫(yī)院 遵義醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院,貴州 遵義 563000;2興義市人民醫(yī)院 貴州醫(yī)科大學附屬興義醫(yī)院)

肺癌位列中國癌癥發(fā)病率和死亡率首位〔1〕,肺鱗癌多見于老年男性,與吸煙關(guān)系密切〔2〕。肺癌的發(fā)生發(fā)展病程復雜,尋找其發(fā)病的分子機制對肺癌的診治具有重要意義。微小RNA(miRNA)通過與靶基因的3′非編碼區(qū)(UTR)結(jié)合對靶基因進行調(diào)控,影響多種疾病的進展。研究顯示,miR-22-3p在胃癌〔3〕、肝癌〔4〕、口腔鱗狀細胞癌〔5〕等腫瘤組織中異常表達,與腫瘤細胞的侵襲、遷移、增殖和凋亡等生物學行為密切相關(guān),還可作為非小細胞肺癌的潛在生物標志物〔6〕。但miR-22-3p在肺鱗癌中的作用仍未明確。Targetscan預測,酪氨酸激酶受體(NTRK)2的3′UTR與miR-22-3p的核苷酸序列存在結(jié)合位點,提示NTRK2可能受miR-22-3p調(diào)控。NTRK2是一種原肌球蛋白受體激酶家族蛋白,但NTRK2對肺鱗癌的作用報道尚少。本課題研究miR-22-3p對肺鱗癌增殖和凋亡的影響,并驗證與NTRK2的靶向關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選用2019年4月至2021年5月經(jīng)遵義市第一人民醫(yī)院手術(shù)切除并病理確診的30例肺鱗癌患者肺癌及癌旁組織標本為研究對象,其中男24例,女6例;平均年齡(65.48±6.82)歲;18例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,12例未發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移。所有患者未進行放化療。本研究經(jīng)患者及家屬知情同意并簽署知情同意書,并通過醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2細胞和實驗試劑 聚合酶鏈反應(PCR)引物(上海生工生物工程有限公司);肺鱗癌H226細胞(中國科學院上海細胞庫);RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gihco公司);胎牛血清(FBS);細胞計數(shù)試劑(CCK-8)、胰蛋白酶、凋亡試劑盒和蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司);Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(Takara有限公司);Lipo fectamineTM3000試劑盒(美國Invitrogen公司);雙熒光色素酶活性檢測試劑盒(美國Promega公司)。

1.3細胞培養(yǎng) H226細胞常規(guī)培養(yǎng),待生長至80%～90%時消化傳代。

1.4細胞分組和轉(zhuǎn)染 以1×105個/孔將對數(shù)生長期的H226細胞接種于6孔板。分別將miR-22-3p抑制劑組(anti-miR-22-3p)及陰性對照組(anti-NC)、NTRK2陰性對照(si-NC)組及NTRK2小干擾RNA(si-NTRK2)組、miR-22-3p mimics與NTRK2過表達載體(miR-22-3p+pcDNA-NTRK2)組、miR-22-3p mimics與空載體(miR-22-3p+pcDNA)組轉(zhuǎn)染至H226細胞。嚴格按照LipofectamineTM3000試劑盒說明書操作。轉(zhuǎn)染2 d后,實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測miR-22-3p和NTRK2基因,Western印跡檢測NTRK2蛋白。

1.5qRT-PCR Trizol法提取總RNA,并通過微量核酸儀檢測RNA純度和濃度,并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA為模板進行PCR。NTRK2下游5′-ACATATTAGGAACCGGATCACC-3′,上游5′-CATGCTCCTGTGACATT-ATGTG-3′;β-actin上游5′-AA-AGGGTGTAACGCAACTA-3′,下游5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′;U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-GGCTTCCCGAATGCAAGC-3′;miR-22-3p上游5′-AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGTA-3′,下游5′-TTGGCGAATGCCAATGGCCGGCCA-3′。NTRK2以β-actin為內(nèi)參,miR-22-3p以U6為內(nèi)參進行PCR擴增。2-ΔΔCt法計算基因相對表達水平。

1.6Western印跡 在各組細胞加入RIPA蛋白裂解液,提取總蛋白并檢測白濃度,各組蛋白(樣品量60 μg)進行凝膠電泳,再轉(zhuǎn)膜封閉,90 min后加入NTRK2(1∶500)一抗,Tis-HCl緩沖液(TBST)洗滌后加入二抗(1∶1 000),室溫孵育2 h,TBST緩沖液反復沖洗3次,每次10 min,然后顯影,置于凝膠成像系統(tǒng)觀察各條帶并用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.7CCK-8檢測細胞增殖 調(diào)整細胞濃度為1×104個/ml,以100 μl/孔接種于96孔板,空白孔加入100 μl完全培養(yǎng)基,每組設(shè)置3個副孔進行常規(guī)培養(yǎng)。分別在鋪板后24、48、72 h取出培養(yǎng)板,吸出培養(yǎng)基,每孔加入100 μl含10% CCK-8試劑的完全培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h,再取出培養(yǎng)板在450 nm波長處檢測吸光度OD值。

1.8流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 以1×104個/孔將各組轉(zhuǎn)染后的H226細胞接種于24孔板。培養(yǎng)2 d后,取1×106個細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后加入1 ml結(jié)合緩沖液。吹打均勻后,加入膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC) 10 μl,室溫避光孵育10 min。再加入PI 5 μl,室溫避光孵育5 min,最后加入結(jié)合緩沖液400 μl,混合均勻后檢測細胞凋亡。

1.9雙熒光色素酶實驗 Targetscan生物信息學軟件預測,miR-22-3p含有與NTRK2的3′UTR結(jié)合的核苷酸序列。將野生型(WT)-NTRK2、突變型(MUT)-NTRK2分別與miR-22-3p mimics及其陰性對照共轉(zhuǎn)染至H226細胞。轉(zhuǎn)染2 d后收集細胞。按雙熒光素酶活性檢測試劑盒步驟進行操作。

1.10統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析,兩兩比較采用配對t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1肺鱗癌組織和癌旁組織中miR-22-3p及NTRK2表達 與癌旁組織相比,肺鱗癌組織中miR-22-3p表達水平明顯降低,NTRK2 mRNA水平明顯升高(P<0.05),見表1,miR-22-3p與TNRK2表達負相關(guān)(r=-0.92,P<0.05)。

表1 miR-22-3p、NTRK2在肺鱗癌組織中的表達

2.2過表達miR-22-3p對H226細胞增殖及凋亡的影響 與miR-NC組比較,miR-22-3p組miR-22-3p表達水平明顯升高,說明miR-22-3p mimics轉(zhuǎn)染成功。與miR-NC組相比,miR-22-3p組72 h細胞增殖活性明顯降低(t=4.29,P=0.04),凋亡率明顯增加(t=7.14,P<0.05),見表2。

表2 過表達miR-22-3p對H226細胞增殖、凋亡率影響

2.3干擾NTRK2對肺鱗癌H226細胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組相比,si-NTRK2組NTRK2 mRNA水平明顯降低(t=32.41,P=0.00),說明si-NTRK2轉(zhuǎn)染成功,H226細胞中NTRK2 mRNA表達明顯降低。與si-NC組相比,si-NTRK2組72 h細胞增殖活性明顯降低(t=4.15,P=0.04),凋亡明顯增加(t=9.92,P=0.00),見表3。

表3 干擾NTRK2對H226細胞增殖、凋亡的影響

2.4過表達NTRK2能部分逆轉(zhuǎn)miR-22-3p的增殖和凋亡作用 與miR-22-3p+pcDNA組比較,miR-22-3p+pcDNA-NTRK2組NTRK2 mRNA水平明顯增高(t=6.45,P=0.00),說明pcDNA-NTRK2轉(zhuǎn)染成功,H226細胞中NTRK2高表達。miR-22-3p+pcDNA-NTRK2組較miR-22-3p+pcDNA組72 h細胞增殖活性明顯增強(t=4.04,P=0.04),凋亡明顯減少(t=4.26,P=0.01),見表4。

表4 過表達NTRK2逆轉(zhuǎn)miR-22-3p對H226細胞增殖、凋亡的影響

2.5miR-22-3p靶向調(diào)控NTRK2 通過targetscan網(wǎng)站預測,miR-22-3p在NTRK2基因3′UTR在第219～226、1 852～1 858個堿基序列上具有相應結(jié)合位點(圖1)。

圖1 miR-22-3p與NTRK2靶點驗證

轉(zhuǎn)染 WT-NTRK2后,再轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimics后H226細胞的熒光素酶活性(0.66±0.04)較miR-NC組(0.99±0.03)明顯降低(t=-11.43,P=0.00);轉(zhuǎn)染MUT-NTRK2后再轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimics,H226細胞的熒光素酶活性(0.97±0.02)較miR-NC組(0.99±0.03)無明顯變化(t=-0.96,P=0.39)。Western印跡結(jié)果顯示,miR-22-3p組H226細胞中NTRK2蛋白水平(0.52±0.04)相較于miR-NC組(0.98±0.04)顯著降低(t=-14.08,P=0.00),anti-miR-22-3p組NTRK2蛋白水平(1.05±0.08)明顯高于anti-NC組(0.89±0.03,t=3.24,P=0.03),見圖2。

圖2 Western印跡檢測各組NTRK2蛋白表達

3 討 論

肺鱗癌具有較高的侵襲性,易復發(fā)和轉(zhuǎn)移,吸煙、電離輻射、空氣污染等多種因素均可能誘發(fā)肺癌。促進細胞凋亡、抑制細胞增殖是治療腫瘤的新方法。miRNA與癌癥密切相關(guān),研究肺鱗癌中異常表達的miRNA及其分子機制,能為臨床診斷和治療肺癌提供新視野。

miR-22-3p在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用,研究顯示,miR-22-3p通過MET/STAT3信號抑制肺癌細胞生長〔7〕,NCK1-AS1通過miR-22-3p/IGF1R ceRNA途徑增強膠質(zhì)瘤細胞增殖、抗放療和化學耐藥〔8〕。miR-22-3p在不同的腫瘤中作用不同,既可作為促癌基因促進腫瘤發(fā)生發(fā)展,也可作為抑癌基因抑制腫瘤生長。目前,miR-22-3p對肺鱗癌生物學行為的影響尚未明確。本研究表達miR-22-3p抑制H226細胞中NTRK2蛋白表達,說明miR-22-3p對NTRK2的表達具有負性調(diào)控作用。本研究還表明,過表達NTRK2部分逆轉(zhuǎn)了miR-22-3p對H226細胞增殖和凋亡的作用,說明miR-22-3p可能靶向NTRK2調(diào)控肺癌的增殖和凋亡。

NTRK2即神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶2型受體,具有受體酪氨酸激酶的活性,對細胞分化、生長發(fā)育起重要作用,與抑郁癥也密切相關(guān)〔9〕。NTRK基因突變是多種腫瘤的致癌驅(qū)動因素,NTRK點突變、插入缺失已在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn),包括肺癌、黑色素瘤和血液腫瘤〔10〕,在毛細胞星形細胞瘤全基因組測序中,也發(fā)現(xiàn)NTRK2融合基因〔11〕。本研究結(jié)果顯示,提示NTRK2也與肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展密不可分。

綜上,miR-22-3p在肺鱗癌組織中低表達,NTRK2在肺鱗癌組織中高表達,miR-22-3p可能通過靶向NTRK2降低H226細胞的增殖能力,并誘導其凋亡,miR-22-3p/NTRK2可能是肺癌靶向治療的新靶點。但由于本研究僅在體外通過細胞實驗研究了miR-22-3p/NTRK2軸對肺鱗癌的影響,后續(xù)將通過動物實驗在體內(nèi)驗證miR-22-3p/NTRK2在肺癌中的作用,為后續(xù)臨床研究提供理論依據(jù)。