梅花 陳小進(jìn) 劉宏達(dá) 邵祥忠

(海安市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,江蘇 海安 226600)

腦梗死主要由動(dòng)脈粥樣硬化所導(dǎo)致,在老年人中具有較高發(fā)病率,可對(duì)患者身心健康造成較大影響,并給家庭帶來(lái)較大負(fù)擔(dān)〔1,2〕。動(dòng)脈粥樣硬化可使患者局部血流中斷,引發(fā)患者腦組織缺血、缺氧,發(fā)生壞死。臨床治療該病的藥物療效較差,故尋找新的治療方法較為重要。銀杏葉提取物具有抗炎、清除自由基、抗氧化的作用,在腦梗死的治療中具有較好效果〔3〕。Toll樣受體(TLR)4/核因子(NF)-κB信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)、免疫損傷中作用較為重要,損傷相關(guān)分子可使TLRs表達(dá)激活,并誘導(dǎo)NF-κB移至細(xì)胞核,促進(jìn)體內(nèi)炎癥因子的釋放,加重機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)〔4,5〕。臨床暫未有研究顯示銀杏葉提取物通過(guò)調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死造成影響,本文分析基于TLR4/NF-κB信號(hào)通路探究銀杏葉提取物對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死大鼠的干預(yù)效果,以明確銀杏葉提取物與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1研究動(dòng)物 選取SPF級(jí)6～8周齡SD大鼠60只,體質(zhì)量(221.42±16.32)g,購(gòu)自廣州銳格生物科技有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(粵)2021-0259,所有大鼠在室溫(22.44±2.18)℃、在濕度65%下飼養(yǎng),每日光照12 h,飼養(yǎng)期間自由飲水。本次實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格參照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2分組與建模 將60只大鼠中10只大鼠作為對(duì)照組,其余50只大鼠參照劉剛等〔6〕研究中動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死大鼠的建立方法構(gòu)建模型,在大鼠腹腔內(nèi)注射400 mg/kg的4.0%水合氯醛進(jìn)行麻醉,將大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈、右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈進(jìn)行分離,并結(jié)扎剪斷頸外動(dòng)脈,采用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈,使用絲線打結(jié)阻斷右側(cè)頸總動(dòng)脈,將頸外動(dòng)脈切口剪開(kāi),注射熒光微球混選清液,形成動(dòng)脈多發(fā)性阻塞,大鼠出現(xiàn)右側(cè)Horner征即為建模成功。共有40只大鼠建模成功,隨機(jī)分為模型組、低劑量組、高劑量組、藥物對(duì)照組各10只。

1.3給藥干預(yù) 建模成功后,開(kāi)始給藥。對(duì)照組、模型組給予生理鹽水進(jìn)行灌胃,低劑量組給予生理鹽水+50 mg/kg銀杏葉提取物進(jìn)行灌服,高劑量組給予生理鹽水+100 mg/kg銀杏葉提取物進(jìn)行灌服,藥物對(duì)照組給予生理鹽水+4 mg/kg丁苯酞進(jìn)行灌服,1次/d,連續(xù)灌胃4 w。

1.4樣本采集 采集大鼠靜脈血2 ml,以轉(zhuǎn)速3 000 r/min、離心15 min,分離上層血清,于-80 ℃保存。

1.5病理組織學(xué)觀察 將大鼠斷頸處死,取大鼠腦組織,剪取0.5 g儲(chǔ)存于-80 ℃,在多聚甲醛中固定4 h,采用乙醇對(duì)其進(jìn)行脫水處理,后進(jìn)行石蠟包埋,制作5 μm薄片,進(jìn)行脫蠟、脫水操作,并采用蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒進(jìn)行染色,光學(xué)顯微鏡觀察其病理變化。

1.6神經(jīng)行為、腦梗死體積檢測(cè) 采用Zea-Longa法評(píng)估神經(jīng)功能,0分:活動(dòng)正常且未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失癥狀;1分:前肢無(wú)法完全伸展;2分:向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:左側(cè)傾倒且無(wú)法自行行走。取大鼠腦組織,切除小腦、嗅球,制作2 mm間距冠狀切片,放入2%氯化三苯基四氮唑染液中,37 ℃下放置30 min,多聚甲醛中固定4 h,觀察大鼠腦梗死體積。

1.7氧化應(yīng)激指標(biāo)、炎癥因子水平檢測(cè) 取各組大鼠冷凍血清解凍,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、腫瘤壞死因子(TNF)-ɑ、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6水平,使用碳酸鹽緩沖液,將待測(cè)液稀釋,后倒入孔中,4 ℃下過(guò)夜處理,后棄去,洗凈,孔中加入1%牛血清白蛋白(BSA),37 ℃孵育60 min,后棄去,洗凈,稀釋抗血清,每孔加入0.1 ml,37 ℃下進(jìn)行輕微搖晃40 min,后棄去,沖洗干凈,使用3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)進(jìn)行顯色處理,后在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度(OD)值。

1.8TLR4、NF-κB mRNA檢測(cè) 取大鼠腦組織,放入液氮中研磨,使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量法進(jìn)行鑒定TLR4、NF-κB表達(dá)量,采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列,反應(yīng)體系:模板DNA 1 μl、0.5 μl上下游引物、20 μl蒸餾水。反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s,70 ℃ 34 s,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán),采用2-ΔΔCt方法計(jì)算出TLR4、NF-κB表達(dá)量。TLR4上游、下游引物序列分別為:5′-TGCTCAGACATGGCAGTTTC-3′、5′-TCAAGGCTTTTCCATCCAAC-3′;NF-κB上游、下游引物序列分別為:5′-AACACTGCCGAGCTCAAGAT-3′、5′-CATCGGCTTGAGAAAAGGAG-3′;內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氧酶(GAPDH)上游、下游引物序列分別為:5′-CCTCACCCTTCCCCAATAAT-3′、5′-GTGTGA-ATGGTGCCTGTGAC-3′。

1.9TLR4/NF-κB蛋白檢測(cè) 取各組腦組織,冰上溶解,25 min后制作組織勻漿,后取0.1 g勻漿加入檢測(cè)試劑提取液,搖晃均勻,分離上層血清,使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒對(duì)TLR4、NF-κB蛋白含量進(jìn)行檢測(cè),定量分析蛋白表達(dá)情況。試驗(yàn)重復(fù)5次。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組組織學(xué)觀察比較 對(duì)照組海馬組織結(jié)構(gòu)完整、清晰,可見(jiàn)細(xì)胞核;模型組海馬組織發(fā)生變化,細(xì)胞減少,結(jié)構(gòu)發(fā)生破損,神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)空泡;低劑量組、高劑量組、藥物對(duì)照組細(xì)胞損傷減輕,神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)空泡數(shù)量減少,細(xì)胞形態(tài)較為完整。見(jiàn)圖1。

圖1 各組海馬組織學(xué)(HE染色,×100)

2.2各組神經(jīng)行為、腦梗死體積對(duì)比 與對(duì)照組相比,其余4組神經(jīng)行為評(píng)分、腦梗死體積顯著升高;與模型組相比,低劑量組、高劑量組、藥物對(duì)照組上述指標(biāo)顯著降低;與低劑量組相比,高劑量組、藥物對(duì)照組上述指標(biāo)顯著降低;與高劑量組相比,藥物對(duì)照組上述指標(biāo)顯著升高(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組神經(jīng)行為、腦梗死體積、氧化應(yīng)激指標(biāo)及TLR4、NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)量對(duì)比

2.3各組氧化應(yīng)激指標(biāo)對(duì)比 與對(duì)照組相比,其余4組MDA水平升高,SOD、CAT水平降低;與模型組相比,低劑量組、高劑量組、藥物對(duì)照組MDA水平降低,SOD、CAT水平升高;與低劑量組相比,高劑量組、藥物對(duì)照組MDA水平降低,SOD、CAT水平升高;與高劑量組相比,藥物對(duì)照組MDA水平升高,SOD、CAT水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4各組炎癥因子水平對(duì)比 與對(duì)照組相比,其余4組TNF-ɑ、IL-1β、IL-6水平升高;與模型組相比,低劑量組、高劑量組、藥物對(duì)照組上述指標(biāo)降低;與低劑量組相比,高劑量組、藥物對(duì)照組上述指標(biāo)降低;與高劑量組相比,藥物對(duì)照組上述指標(biāo)升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.5各組TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)量對(duì)比 與對(duì)照組相比,其余4組TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)量升高;與模型組相比,低劑量組、高劑量組、藥物對(duì)照組上述指標(biāo)降低;與低劑量組相比,高劑量組、藥物對(duì)照組上述指標(biāo)降低;與高劑量組相比,藥物對(duì)照組上述指標(biāo)升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1、圖2。

圖2 Western印跡檢測(cè)各組TLR4/NF-κB信號(hào)通路

3 討 論

腦梗死為多種原因?qū)е碌木植縿?dòng)脈血流減少,可使患者供血區(qū)腦組織缺氧、缺血,導(dǎo)致患者失語(yǔ)、偏癱,損傷患者神經(jīng)功能〔7,8〕。腦梗死發(fā)生后,體內(nèi)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激狀態(tài)可對(duì)患者腦部損傷加重,造成惡性循環(huán),使患者腦組織損傷范圍擴(kuò)大,故尋找減輕患者腦梗死的治療策略較為重要〔9,10〕。

研究顯示〔11,12〕,腦梗死可使患者氧化應(yīng)激損傷加重,導(dǎo)致患者內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷,使患者病情加重。MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化最終產(chǎn)物,為酶系統(tǒng)、非酶系統(tǒng)產(chǎn)生的自由基,可使細(xì)胞代謝功能發(fā)生障礙,檢測(cè)MDA表達(dá)水平,可反映出脂質(zhì)氧化的嚴(yán)重程度,SOD在氧化應(yīng)激反應(yīng)中較為重要,可修復(fù)氧自由基對(duì)機(jī)體造成的損傷,SOD水平降低,表明患者體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)較為劇烈,血清CAT屬于一種酶類清除劑,一般存在于組織內(nèi)的過(guò)氧化體中或是紅細(xì)胞中,可以將機(jī)體內(nèi)過(guò)氧化氫分解成分子氧及水,并將過(guò)氧化氫(H2O2)清除,從而避免了H2O2對(duì)細(xì)胞的毒害〔13〕。

相關(guān)學(xué)者研究顯示〔14,15〕,銀杏葉提取物可調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài),銀杏葉提取物為常見(jiàn)中藥活性成分,其中主要成分銀杏內(nèi)酯、黃酮苷可改善體內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài),并具有抗氧化的作用。該研究結(jié)果與本研究一致,表明采用銀杏葉提取物干預(yù),可減弱氧化應(yīng)激反應(yīng),促使患者恢復(fù)。

腦組織血管閉塞后,可使缺血區(qū)發(fā)生炎癥反應(yīng),分泌TNF-ɑ、IL-1β、IL-6等多種炎癥因子,使周?chē)?xì)胞發(fā)生死亡,對(duì)患者機(jī)體內(nèi)血腦屏障造成破壞,使患者病變區(qū)域擴(kuò)大,故對(duì)患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)進(jìn)行控制,可使患者腦損傷進(jìn)展得到控制,減輕患者血腦屏障損傷〔16,17〕。有關(guān)研究表明〔18,19〕,銀杏葉提取物可使緊密連接蛋白表達(dá)水平升高,保護(hù)患者體內(nèi)血腦屏障,組織大分子物質(zhì)進(jìn)入患者腦組織,抑制機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng),保護(hù)患者神經(jīng)功能。該研究結(jié)果與本研究一致,表明采用銀杏葉提取物進(jìn)行干預(yù),可修復(fù)血腦屏障,控制腦損傷,減輕體內(nèi)炎癥反應(yīng)。

TLR4為免疫受體,在腦缺血引起的炎癥反應(yīng)中具有重要作用,腦梗死的發(fā)生可激活大量小膠質(zhì)細(xì)胞,損傷機(jī)體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞,釋放高遷移率族蛋白(HMG)B1受體,HMGB1受體與TLR4結(jié)合后,可使TLR4通路發(fā)生傳導(dǎo),加重患者病情〔20〕。TLR4可與IL、接頭蛋白發(fā)生結(jié)合,使TNF受體相關(guān)因子(TRAF)6磷酸化為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶(TAK)-1,釋放NF-κB,NF-κB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核后,可生成TNF-ɑ、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子,促進(jìn)炎癥反應(yīng)〔21〕。相關(guān)學(xué)者研究顯示〔22,23〕,銀杏葉提取物可減輕患者神經(jīng)損傷,使TLR4、NF-κB表達(dá)降低,抑制TLR4/NF-κB通路的發(fā)展。該研究結(jié)果與本研究一致,表明銀杏葉提取物可抑制TLR4/NF-κB通路,促使腦梗死大鼠恢復(fù)。