郭學(xué)軍 陳苑 高欣

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,廣東 廣州 510400)

阿爾茨海默病(AD)是以記憶力損害、認(rèn)知功能障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,AD患者主要有神經(jīng)元丟失、β淀粉樣蛋白(Aβ)聚集、神經(jīng)纖維纏結(jié)等病理特征〔1,2〕。AD與糖尿病疾病在流行病學(xué)、組織病理學(xué)、分子生化特征等方面具有相關(guān)性,2型糖尿病可顯著增加AD發(fā)生的概率,AD又被稱為“3型糖尿病”,糖尿病性AD病程長、治療費(fèi)用高,給患者及其家庭帶來沉重負(fù)擔(dān),因此探究治療糖尿病性AD疾病的新型藥物成為近年研究熱點(diǎn)〔3,4〕。糖尿病古稱“消渴”“脾癉”,AD屬于“呆癥”“愚癡”“健忘”等范疇,腎虛是AD發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)之一,金匱腎氣丸主要用于腎虛水腫、腰膝酸軟、陰陽兩虛等疾病的治療,可改善糖尿病患者胰島素抵抗、葡萄糖穩(wěn)態(tài),能減少AD模型大鼠腦部Aβ沉積和神經(jīng)元損傷,可能對糖尿病性AD具有一定治療效果〔5,6〕。磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路是機(jī)體內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路,與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)活動(dòng)聯(lián)系密切,在AD患者Aβ沉積、糖尿病患者胰島素水平調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用〔7,8〕。本研究探究金匱腎氣丸對糖尿病性AD小鼠腦神經(jīng)元凋亡及PI3K/Akt通路的影響。

1 資料與方法

1.1動(dòng)物 APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠(南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院),生產(chǎn)許可證號為SCXK(蘇)2015-0001,體質(zhì)量約20 g。所有小鼠在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級動(dòng)物房中飼養(yǎng),溫度25 ℃左右,相對濕度50%左右。實(shí)驗(yàn)過程中按照動(dòng)物使用的“3R”原則給予人道主義關(guān)懷且經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑及儀器 金匱腎氣丸(Z11020147)購于北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠;鏈脲佐菌素(STZ,貨號:T1507)購于陶素生化;TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(顯色法,C1091)購于上海碧云天;小鼠Aβ42酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(貨號:CS-ELISA1124)購于上海莼試生物技術(shù)有限公司;組織裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(貨號:R0010、PC0020)購于北京索萊寶科技有限公司;兔源PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、GAPDH一抗、羊抗兔IgG抗體(貨號:ab32089、ab8805、ab278545、ab38449、ab9485、ab6721)購于Abcam。血糖檢測儀(型號BIOSENC-Line Clinic 20)購于北京德?？悼瀑Q(mào)有限公司;光學(xué)顯微鏡(型號SMZ745)購于日本尼康公司;血液流變分析儀(型號HL-5000)購于泰安市康宇醫(yī)療器械有限公司;酶標(biāo)儀(型號AMR-100)購于杭州奧盛儀器有限公司;凝膠成像儀(型號GIS-500)購于Miulab公司等。

1.3動(dòng)物模型制備及分組給藥 糖尿病性AD小鼠模型的構(gòu)建參考文獻(xiàn)〔9〕并稍作修改,50只APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠隨機(jī)分為對照組(10只)、造模小鼠(50只),對照組小鼠普通飼料(58.8%碳水化合物、15.4%脂肪、蛋白質(zhì)25.8%)喂養(yǎng),造模小鼠高脂飼料(20%蛋白質(zhì)、40%脂肪、40%碳水化合物)連續(xù)喂養(yǎng)4 w,第4周末禁食12 h,造模組小鼠一次性腹腔注射的65 mg/kg的STZ溶液(1%,STZ溶解于pH為4.4的檸檬酸鈉-檸檬酸溶液中),對照組腹腔注射等量檸檬酸鈉-檸檬酸溶液,注射完成后72 h進(jìn)行尾靜脈取血,測定其中血糖值,連續(xù)3次空腹血糖(FBG)>16.8 mmol/L,有多飲、多尿、多食癥狀為糖尿病性AD造模成功。造模期間有不符合條件或死亡現(xiàn)象發(fā)生,及時(shí)選取備用小鼠進(jìn)行造模實(shí)驗(yàn)。將造模成功的糖尿病性AD小鼠分為模型組、金匱低劑量組(0.35 g/kg)、金匱中劑量組(0.70 g/kg)、金匱高劑量組(1.40 g/kg),每組10只,按照各組給藥劑量進(jìn)行灌胃處理,對照組以生理鹽水替代,持續(xù)灌胃30 d,2次/d。按照人體表法計(jì)算金匱腎氣丸的小鼠給藥劑量,成人金匱腎氣丸每次用量為5 g,2次/d,按照成人體質(zhì)量60 kg,換算系數(shù)采用8.5,則將低、中、高給藥劑量分別設(shè)定為0.35、0.70、1.40 g/kg。

1.4小鼠行為學(xué)檢測 末次給藥結(jié)束后24 h采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測,水迷宮測試儀圓形水池等分為4個(gè)象限(分別稱為1、2、3、4象限),半徑5 cm的圓形透明平臺(tái)低于水平面1 cm置于第1象限中央。定位巡航實(shí)驗(yàn):將小鼠每天同一時(shí)間從第2、3、4象限放入水池中,記錄大鼠從入水到爬上圓形透明平臺(tái)的時(shí)間(潛伏期),潛伏期值越大表明大鼠認(rèn)知功能較差,90 s內(nèi)未找到圓形透明平臺(tái),引導(dǎo)其到平臺(tái)上并停留10 s,潛伏期記為90 s,每只動(dòng)物每天訓(xùn)練4次,共訓(xùn)練4 d?？臻g探索實(shí)驗(yàn):第5天將圓形透明平臺(tái)撤去,記錄小鼠在120 s內(nèi)游過平臺(tái)區(qū)域的次數(shù),次數(shù)越多代表小鼠記憶能力越好。

1.5小鼠血液指標(biāo)及腦組織Aβ42含量檢測 取各組小鼠0.1 ml空腹靜脈血,用血糖儀檢測血糖水平,用血液流變分析儀測定全血黏度、血漿黏度、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞變形指數(shù)。取小鼠空腹尾靜脈血,離心取血清,采用放射免疫分析法測定其中胰島素水平。取小鼠腦組織適量,用Aβ42 ELISA測定其中Aβ42含量,具體操作參考試劑盒說明書的要求。胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR=(血糖水平×胰島素水平)/22.5。

1.6小鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡情況檢測 將小鼠麻醉后處死,腦部皮膚消毒后依次切開皮膚、肌肉、骨膜,分離顱骨使腦組織暴露,用手術(shù)刀小心分離小鼠海馬組織。取5只小鼠海馬組織,在4%多聚甲醛中固定48 h,用生物組織脫水機(jī)對海馬組織進(jìn)行脫水、透明處理,將經(jīng)過透明處理的海馬組織浸于融化的石蠟中,待包埋有海馬組織的石蠟?zāi)毯筮M(jìn)行修剪,用組織切片機(jī)切成厚度約4 μm的切片,將切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、乙醇脫水、多聚甲醛再次固定、磷酸鹽緩沖液沖洗、蛋白酶K通透性處理后放于濕盒中平衡10 min,加入原位末端標(biāo)記法(TUNEL)反應(yīng)液避光反應(yīng)1 h,磷酸鹽緩沖液沖洗后加入轉(zhuǎn)化劑處理30 min,磷酸鹽緩沖液沖洗,加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液,觀察到淺棕色背景后用去離子水沖洗,經(jīng)過蘇木素復(fù)染、沖洗、脫水、透明、封片后于顯微鏡下觀察并分析。神經(jīng)元凋亡率(%)=棕褐色細(xì)胞(陽性細(xì)胞)/視野總細(xì)胞×100%。

1.7小鼠海馬組織凋亡相關(guān)蛋白及PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)檢測 取5只小鼠海馬組織適量,用眼科剪剪碎后加入組織裂解液提取其中總蛋白,1 000 r/min 4 ℃離心10 min后吸取上清液,用BCA蛋白測定試劑盒測定其中蛋白質(zhì)濃度,用組織裂解液將各組蛋白濃度調(diào)至相同,高溫加熱至蛋白質(zhì)變性,取20 μl變形蛋白溶液上樣,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠實(shí)驗(yàn)分離蛋白,濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上,用5%的脫脂奶粉封閉處理2 h,分別加入兔源PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、GAPDH一抗(1∶500),4 ℃環(huán)境孵育過夜,用TBST緩沖溶液沖洗后加入羊抗兔二抗IgG(1∶1 000),用TBST緩沖溶液沖洗后顯色,于凝膠成像儀中觀察并分析各組小鼠海馬組織中蛋白表達(dá)情況。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism8軟件進(jìn)行方差分析,進(jìn)一步兩組間比較進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1金匱腎氣丸對糖尿病性AD小鼠行為學(xué)影響 潛伏期的時(shí)間變化與組別存在交互效應(yīng)(P<0.05)。隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長,各組小鼠潛伏期呈現(xiàn)降低趨勢;與對照組相比,模型組潛伏期顯著升高,穿臺(tái)次數(shù)顯著減少(均P<0.05);與模型組相比,金匱各劑量組潛伏期顯著降低,穿臺(tái)次數(shù)顯著升高(均P<0.05),且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng),其中金匱高劑量組效果較好。見表1。

表1 各組行為學(xué)檢測

2.2金匱腎氣丸對糖尿病性AD小鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的影響 與對照組相比,模型組全血黏度、血漿黏度、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著升高(P<0.05);與模型組相比,金匱各劑量組全血黏度、血漿黏度、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著降低,且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng),其中金匱高劑量組效果較好。見表2。

表2 各組血液流變學(xué)指標(biāo)、血糖水平及血清胰島素水平比較

2.3金匱腎氣丸對糖尿病性AD小鼠血糖及胰島素水平的影響 與對照組相比,模型組血糖水平、血清胰島素水平、HOMA-IR、腦組織Aβ42含量顯著升高(均P<0.05);與模型組相比,金匱各劑量組血糖水平、血清胰島素水平、HOMA-IR、腦組織Aβ42含量顯著降低(P<0.05),且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng),其中金匱高劑量組效果較好。見表2。

2.4金匱腎氣丸對糖尿病性AD小鼠腦神經(jīng)元凋亡的影響 與對照組相比,模型組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低;與模型組相比,金匱各劑量組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低,Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05),且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng),其中金匱高劑量組效果較好。見表3、圖1、圖2。

1～5:對照組、模型組、金匱低、中、高劑量組;下圖同圖2 各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表3 各組腦神經(jīng)元凋亡率、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及海馬組織PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)比較

2.5金匱腎氣丸對糖尿病性AD小鼠海馬組織PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比,模型組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與模型組相比,金匱各劑量組小鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng),其中金匱高劑量組效果較好。見表3、圖3。

圖3 各組海馬組織PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)

3 討 論

以前AD和糖尿病常作為兩項(xiàng)獨(dú)立的代謝疾病進(jìn)行研究,近年來的研究發(fā)現(xiàn)糖尿病認(rèn)知障礙患者的發(fā)病率不斷增加,許多流行病學(xué)都將AD與糖尿病的發(fā)生聯(lián)系在一起,研究證實(shí)糖尿病患AD的概率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非糖尿病人群,糖尿病血糖水平紊亂、胰島素抵抗被認(rèn)為是糖尿病增加AD相關(guān)病理的主要機(jī)制之一〔10～13〕。

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為糖尿病屬于“消渴”范疇,陰虛為主、燥熱為標(biāo),有脾腎虧虛等生理特點(diǎn),AD屬于中醫(yī)“呆癥”范疇,多有脾腎虧虛、腦髓不充、清陽不升等表現(xiàn),脾腎虧虛為主的臟器功能衰退可加重患者腦神經(jīng)元損傷、Aβ沉積,造成腦神經(jīng)元大量凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致患者認(rèn)知功能障礙加劇〔6,14〕。中藥治療具有作用溫和、持久、不良反應(yīng)小等多種優(yōu)點(diǎn),金匱腎氣丸含有地黃、山藥、山茱萸、茯苓等多種傳統(tǒng)中藥,有補(bǔ)腎益智之功效,在改善、治療糖尿病方面存在一定的優(yōu)勢,在改善老年癡呆患者生活活動(dòng)能力、認(rèn)知功能等方面具有較好的療效〔15,16〕。本研究結(jié)果提示金匱腎氣丸可顯著改善糖尿病AD小鼠的認(rèn)知功能障礙等不良表現(xiàn)。

PI3K/Akt通路是機(jī)體內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路,在細(xì)胞存活、增殖、凋亡等生物學(xué)活動(dòng)中發(fā)揮重要作用,與AD患者神經(jīng)元凋亡、腦組織氧化應(yīng)激等反應(yīng)聯(lián)系密切,PI3K通過磷酸化肌醇環(huán)上的3位羥基生成二磷酸磷脂酰肌醇,進(jìn)而將信號傳遞給下游蛋白并激活A(yù)kt,激活的PI3K/Akt通路具有促進(jìn)細(xì)胞生存、抗細(xì)胞凋亡等作用〔17,18〕。Li等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)激活PI3K/Akt通路對于AD后腦神經(jīng)元的恢復(fù)具有促進(jìn)作用,Wang等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)激活PI3K/Akt通路可降低小鼠血糖水平,減輕2型糖尿病小鼠的胰島素抵抗。本研究結(jié)果提示金匱腎氣丸具有改善糖尿病性AD小鼠神經(jīng)元凋亡、胰島素抵抗的作用可能與激活PI3K/Akt通路有關(guān);但本文未設(shè)置相應(yīng)的通路抑制劑或激活劑進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn),接下來應(yīng)通過設(shè)置相關(guān)對比實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證金匱腎氣丸的作用機(jī)制。