董良鵬 杜學(xué)芳 張超群 韓宇 張彩鳳

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,河南 新鄉(xiāng) 453100)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種原因不明的慢性非特異性炎癥反應(yīng),涉及直腸和結(jié)腸〔1〕。免疫反應(yīng)在UC的發(fā)生和進展中起至關(guān)重要的作用,在UC期間,有助于炎癥的T輔助細(xì)胞(Th)17群體通常會增加,而抑制Th17活性的調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)則會減少〔2〕。UC的腸道炎性反應(yīng)會受到轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/Smad2通路的調(diào)節(jié),研究顯示結(jié)腸黏膜中TGF-β和Smad2表達上調(diào)會促進炎性損傷〔3〕。此外,T細(xì)胞分化和成熟也受到TGF-β1/Smad2通路調(diào)節(jié),其會促進Th17/Treg向Th17偏移〔4〕?，F(xiàn)階段治療UC的方法主要為對癥治療,近年來中藥在治療UC和改善免疫中取得了長足進展,一項臨床研究顯示芪倍合劑(豫藥制字Z04070018)具有治療UC的作用〔5〕,但具體機制尚不清楚。本文主要分析芪倍合劑對UC大鼠的影響并探究作用機制,為臨床更好地應(yīng)用芪倍合劑治療UC提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料 BALB/c小鼠(SPF,雄性,6～7周齡,體質(zhì)量22～26 g,編號:SCXK 廣東 2011-0015)。試劑及儀器包括葡聚糖硫酸鈉(DSS,Sigma,美國)、芪倍合劑(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,100 ml/瓶)、逆轉(zhuǎn)錄和SYBR Green PCR Master Mix q聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(Roche公司,瑞士)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天公司,中國)、流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司,美國)、BD Mouse Foxp3固定緩沖液、通透緩沖液和小鼠Treg/Th17表型抗體試劑(BD Biosciences公司,美國)、免疫磁珠(Invitrogen公司,美國)、anti-TGF-β1和anti-Smad2(Abcam公司,美國)、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad公司,美國)、倒置熒光顯微鏡(Olympus公司,日本)。

1.2分組、建模和干預(yù) 小鼠在溫度22～25 ℃,12 h明/暗循環(huán)、相對濕度約為55%的潔凈動物室內(nèi)飼養(yǎng),自由飲水和飲食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后,將30只小鼠隨機分為對照組、UC組和UC+芪倍合劑組,每組10只。UC組和UC+芪倍合劑組根據(jù)參考文獻〔6〕使用DSS誘導(dǎo)小鼠UC,將小鼠飲用水換為2.5%(W/V)的DSS溶液,連續(xù)7 d,然后換為正常飲用水3 d。UC+芪倍合劑組使用芪倍合劑灌腸,根據(jù)參考文獻〔6〕通過體質(zhì)量換算得到芪倍合劑劑量為1.5 ml,每日1次,連續(xù)7 d,對照組和UC組給予等量生理鹽水。使用Murthy評分系統(tǒng)記錄每日疾病活動指數(shù)(DAI)〔7〕,大鼠出現(xiàn)糞便稠度變化和便血為建模成功。

1.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測炎性因子 在小鼠處死前進行眼眶取血,離心20 min(120 000 r/min)后獲得血清,通過試劑盒加入抗體檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-4水平,然后在450 nm下測量吸光度(OD)值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算TNF-α、IL-1、IL-4水平。

1.4HE染色檢測結(jié)腸黏膜病變 通過頸脫臼處死小鼠,立即取新鮮的結(jié)腸組織在10%中性甲醛緩沖液中,包埋在石蠟中,分別使用蘇木素和伊紅染料,在顯微鏡下觀察。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17/Treg水平 將外周血經(jīng)過密度梯度離心后抽吸淋巴細(xì)胞層,獲得單個淋巴細(xì)胞懸浮液。細(xì)胞用20 μl預(yù)冷的1×BD鼠Foxp3固定緩沖液處理,并在暗室中于4 ℃固定30 min,然后洗滌固定劑并收集細(xì)胞。隨后加入200 μl預(yù)熱的1×BD鼠Foxp3通透緩沖液,并將細(xì)胞在37 ℃暗室中孵育30 min。洗去通透緩沖液,將細(xì)胞與20 μl小鼠Treg/Th17表型抗體試劑或?qū)φ湛贵w在室溫下孵育30 min。然后將抗體洗掉,將細(xì)胞重懸并通過FACSCalibur流式細(xì)胞儀進行分析。

1.6Western印跡檢測蛋白表達 采用密度梯度離心分法離單個核細(xì)胞〔9〕,然后使用免疫磁珠分離淋巴細(xì)胞。將細(xì)胞和結(jié)腸黏膜組織裂解后分離總蛋白,并通過二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度,將等量總蛋白通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離(120 V,90 min),經(jīng)轉(zhuǎn)膜后分別加入anti-TGF-β1和anti-Smad2(1∶500稀釋)孵育過夜,然后加入二抗在室溫下孵育1 h。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒通過灰度分析蛋白相對表達水平。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析,兩兩比較通過LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組DAI評分比較 建模后UC組和UC+芪倍合劑組均出現(xiàn)便血情況。與對照組比較,干預(yù)后UC組DAI評分顯著升高(P<0.05);與UC組比較,干預(yù)后UC+芪倍合劑組DAI評分顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組DAI評分、TNF-α、IL-1、IL-4、Th17、Treg及Th17/Treg水平比較

2.2各組炎性因子水平比較 與對照組比較,UC組TNF-α、IL-1水平顯著升高而IL-4水平顯著降低(P<0.05)。與UC組比較,UC+芪倍合劑組TNF-α、IL-1水平顯著降低而IL-4水平顯著升高(P<0.05),見表1。

2.3各組結(jié)腸黏膜病變情況 對照組結(jié)腸黏膜完全正常;UC組表現(xiàn)出急性炎癥,伴有黏膜糜爛、水腫、隱窩減少,并且在黏膜下層和固有層中存在中性粒細(xì)胞和其他炎性細(xì)胞。與UC組比較,UC+芪倍合劑組結(jié)腸黏膜基本正常,炎性浸潤明顯減少,見圖1。

圖1 各組結(jié)腸黏膜病變(HE染色)

2.4各組Th17/Treg水平比較 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,與對照組比較,UC組Th17水平升高,Treg水平降低,Th17/Treg升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與UC組比較,UC+芪倍合劑組Th17水平和Th17/Treg顯著降低,Treg水平顯著升高(P<0.05)。見表1和圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測芪倍合劑對UC小鼠Th17/Treg水平的影響

2.5各組結(jié)腸黏膜及淋巴細(xì)胞TGF-β1/Smad2水平比較 結(jié)腸黏膜及淋巴細(xì)胞中,UC組TGF-β1/Smad2水平顯著高于對照組;UC+芪倍合劑組TGF-β1/Smad2水平顯著低于UC組(P<0.05),見圖3和表2。

圖3 Western印跡檢測芪倍合劑對UC小鼠結(jié)腸黏膜及淋巴細(xì)胞中TGF-β1/Smad2水平的影響

表2 各組結(jié)腸黏膜及單個淋巴細(xì)胞TGF-β1/Smad2水平比較

3 討 論

UC臨床癥狀包括腹瀉、腹痛和直腸出血,輕癥UC可見彌漫性炎癥、黏膜充血和水腫,重癥UC會出現(xiàn)局灶性出血。該病通常是臨床復(fù)發(fā)和緩解交替出現(xiàn)的階段。目前,UC的發(fā)病機制仍不清楚。遺傳因素、腸道環(huán)境、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和感染均可能與UC有關(guān)〔8〕。臨床上治療UC的主要方法為抗炎和對癥治療,但是對于炎癥反應(yīng)控制不良的患者需要進行手術(shù)。

現(xiàn)階段尚無關(guān)于治療UC的特效方法,中藥在UC的治療中得到了越來越廣泛的應(yīng)用,芪倍合劑主要成分為黃芪、附子和大黃,研究顯示芪倍合劑具有改善腸道應(yīng)激的作用〔9〕。一項臨床研究顯示在雙歧桿菌四聯(lián)活菌片的基礎(chǔ)上聯(lián)合芪倍合劑可以更有效緩解炎癥反應(yīng),并具有提高機體免疫力的作用〔5〕。本研究結(jié)果顯示芪倍合劑可以顯著抑制機體的炎性因子水平,并緩解結(jié)腸黏膜的炎性反應(yīng)。黃芪是芪倍合劑的主要成分,可以解毒生肌,固表益氣,已經(jīng)有研究顯示其活性單體黃芪甲苷具有緩解UC大鼠模型炎性反應(yīng)、保護結(jié)腸黏膜完整性的作用〔10〕。附子具有溫陽散寒止痛、回陽救逆的作用,臨床研究顯示聯(lián)合附子可以提高美沙拉嗪對UC的療效〔11〕。大黃具有瀉火涼血、活血化瘀之功效,在UC中也具有顯著作用〔12〕。這提示芪倍合劑具有抑制炎性反應(yīng),治療UC的作用。

越來越多的證據(jù)表明UC涉及異常的免疫反應(yīng),獲得性免疫在UC發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用,UC患者Th17細(xì)胞水平被上調(diào),其可通過分泌細(xì)胞因子促進炎性反應(yīng),Th17的作用與Treg拮抗,UC中Treg水平下降,調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡,不但可以改善免疫和炎性反應(yīng),還可改善預(yù)后〔13,14〕。TGF-β1/Smad2通路是參與免疫炎癥反應(yīng)的重要通路,TGF-β1/Smad2通路的激活一方面可以促進結(jié)腸黏膜釋放細(xì)胞因子,招募炎性因子引起結(jié)腸黏膜的炎性損傷〔15〕,另一方面,淋巴細(xì)胞中TGF-β1/Smad2通路激活可以使Treg/Th17平衡向Th17偏移,引起免疫異?！?6〕;與本研究結(jié)果一致。研究顯示芪倍合劑可以有效調(diào)節(jié)Treg/Th17細(xì)胞平衡改善機體免疫反應(yīng)〔17〕。黃芪中的活性成分可以調(diào)節(jié)膠原性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中Treg/Th17平衡,減少Th17細(xì)胞的活化〔18〕。黃芪也可以調(diào)節(jié)TGF-β1途徑抑制纖維化〔19〕。附子也具有抑制TGF-β1/Smad2通路的作用〔20〕。本研究結(jié)果提示,芪倍合劑可以通過抑制結(jié)腸黏膜中TGF-β1/Smad2通路保護結(jié)腸黏膜,也可以通過抑制淋巴細(xì)胞的TGF-β1/Smad2通路調(diào)節(jié)Treg/Th17細(xì)胞平衡調(diào)控免疫反應(yīng)。關(guān)于芪倍合劑調(diào)控TGF-β1/Smad2的機制則需要進一步研究。