杜春燕 左培培 章金濤 朱奎成

(鄭州大學(xué) 1醫(yī)學(xué)科學(xué)院,河南 鄭州 450052;2華中阜外醫(yī)院;3國家心血管病中心華中分中心)

炎性衰老是指機體隨年齡增長出現(xiàn)的長期慢性促炎癥反應(yīng)進行性升高的病理性狀態(tài),其顯著特征是機體隨年齡的增長出現(xiàn)炎癥穩(wěn)態(tài)的失衡,從而引發(fā)細胞和機體逐漸向促炎過程的傾斜,進而發(fā)生的炎性衰老癥狀〔1～3〕。炎性衰老過程中,白細胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α及C反應(yīng)蛋白(CRP)等體內(nèi)多種炎癥因子水平普遍升高,機體為對抗外來威脅而進行正常的抗炎作用日益減弱,最終表現(xiàn)為慢性衰老狀態(tài)〔4〕。

鄭州大學(xué)實驗動物中心(原河南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)在1990年發(fā)現(xiàn)一種KM無毛突變小鼠,將其命名為豫醫(yī)無毛小鼠(YYHL),該小鼠為Hairless(Hr)基因自發(fā)突變小鼠,主要特征為無毛小鼠剛出生時仔鼠正常,從14 d開始脫毛,大約持續(xù)到21日齡被毛全部脫完,此時皮膚顏色呈肉色,到120日齡時無毛小鼠的皮膚顏色逐漸加深,并有許多油脂黏附其上,皮膚角化過度,眼球變得混濁、不突出,老齡鼠視力低,接觸性、敏感性、行動性均降低,壽命約為野生小鼠的1/2,6月齡無毛小鼠衰老特征明顯,因此無毛小鼠可作為衰老動物模型。

鄭州大學(xué)實驗動物中心微生物檢測室于2016年采用TALENs技術(shù)成功構(gòu)建C57背景來源的Hr敲除小鼠(Hr-KO),該鼠與野生型鼠雜交獲得陽性F1子代,然后進行同窩交配,當傳至F2代時,小鼠14 d開始脫發(fā),至30 d左右毛發(fā)完全脫凈,并終身保持無毛〔5〕。這與豫醫(yī)無毛小鼠形狀類似,通過對其壽命觀察,發(fā)現(xiàn)其同樣表現(xiàn)出壽命較正常小鼠短,多為8～9個月。無毛小鼠出現(xiàn)的早期衰老表明其可作為良好的衰老動物模型,用于衰老的相關(guān)研究。本文擬探討Hairless基因敲除小鼠發(fā)生炎性衰老的可能機制。

1 材料與方法

1.1動物 6月齡雄性SPF級WT(野生型C57BL/6J)小鼠12只,購自河南省實驗動物中心,合格證號編號為SCXK(豫)2017-0001。12只6月齡雄性SPF級Hr-KO小鼠由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物平臺。

1.2儀器和試劑 超低溫冷凍冰箱購自青島海爾特種電器有限公司,全自動酶標儀購自上海賽默飛儀器有限公司,實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)儀購自美國BIO-RAD公司,病理相關(guān)設(shè)備購自德國LEICA公司,水迷宮系統(tǒng)、大小鼠跑步機購自江蘇賽昂斯生物科技有限公司,組織破碎研磨儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司。蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司,RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自大連Takara公司,IL-6、IL-1β、TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司,超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司。

1.3皮膚形態(tài)學(xué)觀察 肉眼觀察兩組小鼠皮膚面貌和形態(tài)學(xué)特征。

1.4組織HE染色 取1～2 cm2小鼠背部皮膚組織,脫水、浸蠟、包埋后切片,按照HE染色試劑盒說明進行透明、復(fù)水、染色、封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織切片并做圖像采集。

1.5水迷宮實驗檢測小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力 行為學(xué)實驗開始前應(yīng)進行游泳訓(xùn)練,可讓小鼠在水池內(nèi)自由游泳,每天訓(xùn)練2次,上、下午各1次,每次1 min〔6〕。正式實驗時,在水池內(nèi)固定位置安置平臺,離池壁約20 cm。將小鼠放入水中,每天測試1次,每次2 min,連續(xù)4 d,記錄小鼠尋找并爬上平臺所需的時間。2 min內(nèi)未成功發(fā)現(xiàn)平臺的,時間標為2 min。定位航行實驗結(jié)束24 h后,撤除水下平臺,任選1個入水點將小鼠面向池壁放入水中,所有小鼠均在同一點入水,記錄動物在2 min內(nèi)第1次跨越平臺時間和跨越平臺次數(shù)等指標。實驗期間,室內(nèi)應(yīng)保持安靜,水溫保持在24～25 ℃。水池周圍的參照物在實驗期間保持不變。

1.6跑步實驗檢測小鼠運動耐力 實驗前1 w內(nèi),應(yīng)進行跑步機適應(yīng)訓(xùn)練,連續(xù)訓(xùn)練3 d。跑道坡度調(diào)節(jié)為10 °,打開電源開關(guān),將小鼠放入跑道,開啟電源,將電流調(diào)至合適位置,起始速度設(shè)置為10 m/min,按下啟停開始,持續(xù)時間為10 min。第4天進行正式實驗,初始速度定為12 m/min,持續(xù)時間為20 min,然后以0.3 m/min的速度加速,直到小鼠力竭〔7〕。應(yīng)詳細記錄每個跑道的電擊次數(shù)及每個速度下的實際跑步時間。力竭判定標準:動物落入電擊區(qū)域,經(jīng)連續(xù)電擊后無反應(yīng)。

1.7ELISA檢測IL-6、IL-1β、TNF-α、SOD、MDA水平 剪尾法取小鼠新鮮血液,室溫下在EP管中靜置1 h后3 000 r/min離心15 min,取上清。取小鼠背部皮膚1 cm2左右,生理鹽水沖洗干凈,置于生理鹽水,4 ℃下研磨制成10%勻漿,3 000 r/min離心15 min,取上清液。分別按說明書檢測血清中IL-6、IL-1β、TNF-α及皮膚組織中SOD、MDA水平。

1.8實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測皮膚組織中彈性蛋白原(tropoelastin)和纖維蛋白(fibrillin)-1表達水平 取小鼠背部皮膚1 cm2,采用組織破碎儀破碎后利用Trizol法提取組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作,配制反應(yīng)體系,上機條件設(shè)置如下:95 ℃ 2 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循環(huán)35次。以GAPDH為內(nèi)參基因。Tropoelastin正向引物:5′-CCCCAAGCTGCCTGGTG-3′,反向:5′-AACCAGCCTTGCCCGC-3′,fibrillin-1正向引物:5′-TGTGTCCAGCGGGGCATTTG-3′,反向:5′-CCCTGCGAG-ATGTGTCCTGC-3′,GAPDH正向引物:5′-TGTGTCCGTCGTCGTGGATCTGA-3′,反向:5′-TTGCTGTT-GAAGTCGCAGGAG-3′。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1動物皮膚觀察 通過肉眼直接觀察可見,與WT組相比,Hr-KO組小鼠全身無毛,且皮膚皺紋和褶痕顯著,皮膚呈暗黃色,衰老特征明顯。見圖1。

圖1 兩組皮膚形態(tài)學(xué)比較

2.2HE染色觀察小鼠皮膚病理改變 組織學(xué)染色發(fā)現(xiàn),與WT組比較,Hr-KO組小鼠毛發(fā)生長缺陷,皮膚內(nèi)毛囊瓦解,并形成許多橢圓囊及真皮包囊,表皮增厚明顯,且皮膚不同部位有炎癥細胞浸潤。見圖2。

圖2 兩組皮膚病理改變(HE染色,×400)

2.3各組皮膚組織中tropoelastin和fibrillin-1 mRNA表達水平 Hr-KO組tropoelastin和fibrillin-1 mRNA表達水平均明顯低于WT組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組tropoelastin和fibrillin-1 mRNA表達水平、水迷宮實驗運動時間、距離和穿越平臺次數(shù)、跑臺力竭運動距離及電擊次數(shù)比較

2.4兩組學(xué)習(xí)和記憶能力比較 與WT組相比,Hr-KO組潛伏時間明顯較長,運動距離明顯變長,穿越平臺次數(shù)明顯較少(P<0.05)。見表1。

2.5兩組運動能力比較 與WT組相比,Hr-KO組力竭運動距離明顯較短,且整個實驗過程中,被電擊次數(shù)明顯較多(P<0.05),見表1。

2.6各組血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平及皮膚組織中SOD、MDA水平比較 與WT組比較,Hr-KO組血清中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達水平均明顯升高;Hr-KO組SOD水平明顯低,且Hr-KO組MDA水平明顯高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組血清中炎癥因子及皮膚組織中SOD、MDA水平比較

3 討 論

衰老是一個十分復(fù)雜的生命過程,是一種必然發(fā)生的生理學(xué)現(xiàn)象,伴隨著出現(xiàn)各個組織、器官及細胞的生理功能的逐漸退化和喪失〔8～11〕。

炎癥是驅(qū)動人類衰老的進程的重要因素之一〔12〕。自由基、炎癥和衰老三者關(guān)系密切且錯綜復(fù)雜,已逐漸成為衰老相關(guān)研究的熱點問題。炎性衰老過程中,機體慢性炎癥反應(yīng)呈進行性升高的狀態(tài),其基本機制主要是衰老機體促炎癥細胞因子網(wǎng)絡(luò)與抗炎癥細胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡失調(diào),體內(nèi)炎性因子水平呈慢性升高狀態(tài),最終表現(xiàn)為促炎反應(yīng)的升高。體內(nèi)外許多因素被證實與衰老有關(guān),可分為內(nèi)源性因素和外源性因素,其中內(nèi)源性因素影響最大的是自由基對身體的傷害,當機體發(fā)生氧化應(yīng)激時,自由基可導(dǎo)致生物分子的氧化損傷,進而引起機體內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式(DAMPS)的產(chǎn)生和細胞因子的大量釋放〔13,14〕。細胞因子進而激發(fā)模式識別受體(PRRS)的活化,激活下游的核因子(NF)-κB、非受體型酪氨酸蛋白激酶(JAK)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號通路,從而導(dǎo)致細胞因子和趨化因子釋放,招募和激活炎性細胞,激活炎癥信號通路,釋放炎性因子,最終引起機體系統(tǒng)性慢性炎癥反應(yīng)〔15〕。本文利用Hr-KO無毛小鼠作為衰老的動物模型,初步探討了敲除Hr基因形成的無毛早衰小鼠在皮膚、學(xué)習(xí)記憶能力和運動能力等方面與健康小鼠的差異,分析比較了兩組動物在炎癥因子和抗氧化分子SOD、MDA表達水平的差異,為進一步揭示炎癥、氧化損傷與衰老的關(guān)系提供了參考。