吳江立 徐紅俊 崔清卓 周路陽 趙薇 周勇杰 張宇 寧浚達(dá) 馮慧敏 安勝軍,

(1河北中醫(yī)學(xué)院科研中心,河北 石家莊 050200;2河北省植物生物反應(yīng)器制備技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室;3河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院)

動(dòng)脈粥樣硬化是誘發(fā)心血管疾病的主要因素,病變累及主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈。如果冠狀動(dòng)脈血管壁上脂質(zhì)大量沉積,血管壁增厚,會(huì)進(jìn)一步形成斑塊,堵塞血管,導(dǎo)致心肌缺血,進(jìn)一步可引發(fā)心肌梗死〔1〕。ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠常用于高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的造模。有研究報(bào)道,血液中膽固醇含量過高與心室重構(gòu)有密切關(guān)系〔2〕。有關(guān)ApoE-/-小鼠發(fā)生心肌損傷的機(jī)制和藥物治療作用的相關(guān)報(bào)道很少。丹參是唇形科植物丹參的根,在中醫(yī)古籍中有記載“一味丹參,功同四物”。目前在臨床上已經(jīng)廣泛用于心腦血管疾病的治療。丹參的傳統(tǒng)使用方式為煎煮,其有效活性成分可以在水中溶解。關(guān)于丹參水提物的研究有許多新的發(fā)現(xiàn)。例如,丹酚酸(Sal)-A可以減弱ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈瘤的形成〔3〕,抗心肌缺血〔4〕。Sal-B具有抑制成纖維細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)化的作用〔5〕,丹參素(DSS)可阻止心室重構(gòu)〔6〕。原兒茶醛(PAL)對(duì)心血管系統(tǒng)具有抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用。中藥配伍是臨床用藥的主要形式,有效成分組合是中藥配伍的新模式。實(shí)驗(yàn)室前期研究〔7〕確定了其最佳配伍組合并命名為SABP(Sal-A+Sal-B+DSS+PAL),且發(fā)現(xiàn)SABP可以降低血壓,改善血管重構(gòu)。但SABP 是否對(duì)心臟有保護(hù)作用尚不得知。本研究主要觀察SABP是否對(duì)ApoE-/-小鼠的心臟具有保護(hù)作用并探索其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1藥物和試劑 DSS(76822-21-4)、Sal-A(96574-01-5)、Sal-B(115939-25-8)和PAL(139-85-5)購自上海扶生有限公司;Toll樣受體(TLR)4抗體購自上海江萊生物科技有限公司;核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB p65(GB11142)、白細(xì)胞介素(IL)-6(GB11117)、轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶(TAK)1(GB11701)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(GTX110520)和組蛋白H3 (GB13102-1)抗體購自武漢塞維爾公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH,AC033)抗體購自Abclonal公司;羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗購自KPL公司,核蛋白提取試劑盒(P0027)購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和處理 30只雄性ApoE-/-小鼠和10只C57BL/6J小鼠(6周齡,體質(zhì)量18～22 g)購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:2016-0010。小鼠飼養(yǎng)在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的環(huán)境下(12 h光照/黑暗周期,22 ℃),自由飲食和飲水。適應(yīng)1 w后,30只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為:模型(Model)組、SABP組、潤舒伐他汀(RC)組;C57BL/6小鼠作為正常對(duì)照(Control)組。RC組每天腹腔注射0.4 mg/kg 的RC,SABP組每天腹腔注射丹參四種水溶性成分的有效組合(DSS:5 mg/kg,Sal-A:0.233 mg/kg,Sal-B:10.000 mg/kg,PAL:17.000 mg/kg)。Control組和Model組小鼠每天腹腔注射等劑量的生理鹽水。8 w后,麻醉小鼠,收集血清和心臟。

1.3血清脂類測(cè)量 通過全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總膽固醇(TC),三酰甘油(TG),高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的水平。

1.4組織形態(tài)學(xué)研究 心臟固定在4%多聚甲醛,梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、在切片機(jī)上切出厚度6 μm左右的切片,蘇木素-伊紅(HE)染色觀察心臟形態(tài)學(xué)改變。

1.5免疫組化 將心臟組織切片在60 ℃烘箱烘烤1 h,隨后二甲苯脫蠟,梯度酒精復(fù)水,用檸檬酸緩沖液進(jìn)行高壓修復(fù)抗原,冷卻至室溫后,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,隨后加入TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-α進(jìn)行孵育過夜,PBS清洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,中性樹膠封片后觀察。

1.6Western印跡檢測(cè)蛋白變化 將心臟組織勻漿,根據(jù)說明書提取總蛋白和核蛋白。采用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。隨后,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h,一抗孵育過夜〔TLR4(1∶1 000),NF-κB(1∶1 000),IL-6(1∶1 000),TAK-1(1∶750),GAPDH(1∶10 000)和H3(1∶10 000)〕,隨后用辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合的二抗孵育,電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色,在凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1SABP對(duì)血清脂類的影響 如表 1所示,與Control組比較,Model組血清TC、TG和LDL-C水平明顯升高,HDL-C水平顯著降低(P<0.05);與Model組比較,SABP組顯著降低血清TG、TC和LDL-C水平(P<0.05);RC組血清脂類水平和Model組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2SABP對(duì)心臟形態(tài)學(xué)的影響 如圖1所示,心臟組織的HE染色顯示,Control組心肌纖維排列整齊,心肌細(xì)胞核位于細(xì)胞中心,呈橢圓形或者圓形,細(xì)胞質(zhì)呈粉色,均一,心肌纖維未見明顯增厚、充血等病變。Model組心臟心肌細(xì)胞排列比較松散、心肌細(xì)胞大小不一,胞質(zhì)染色不均勻,局部淡染。SABP和RC組心肌細(xì)胞排列較整齊,胞質(zhì)染色均勻,心肌結(jié)構(gòu)接近正常。

2.3SABP對(duì)心臟TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響 免疫組化和Western印跡結(jié)果顯示,與Control組相比,Model組心臟組織中TLR4、TAK1、IL-6和TNF-α表達(dá)增多,NF-κB被激活(P<0.05),見表2、表3,SABP和RC可以顯著降低心臟組織中TLR4、TAK1、IL-6和TNF-α的表達(dá),抑制NF-κB激活(P<0.05),見圖2、圖3。

圖2 Western印跡檢測(cè)各組心臟中TLR4、NF-κB、IL-6和TAK1表達(dá)

圖3 免疫組化檢測(cè)TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-α在各組心臟中表達(dá)(×200)

表2 免疫組化檢測(cè)各組TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α表達(dá)

3 討 論

ApoE-/-小鼠無論飼喂基礎(chǔ)飲食還是高脂飲食均可形成高脂血癥。血脂在血管壁沉積可進(jìn)一步導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化,如若發(fā)生在冠狀動(dòng)脈,心肌細(xì)胞缺血缺氧,進(jìn)一步導(dǎo)致心臟功能減退、心肌纖維化,心室發(fā)生重構(gòu)〔8,9〕。有文獻(xiàn)報(bào)道,ApoE-/-小鼠正常飲食7個(gè)半月,顯示出明顯的心臟重構(gòu)〔10〕,也有報(bào)道稱4周齡ApoE-/-小鼠正常飲食出現(xiàn)左心室肥大〔11〕。本實(shí)驗(yàn)說明飼喂普通飲食8 w ApoE-/-小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的高脂血癥;丹參四種水溶性成分的有效組合SABP可以降低ApoE-/-小鼠血脂;6周齡ApoE-/-小鼠飼喂基礎(chǔ)飲食8 w發(fā)生了心肌組織損傷。經(jīng)SABP治療后,心肌組織形態(tài)學(xué)改變有所改善。說明SABP可以減少ApoE-/-小鼠心肌組織損傷,對(duì)心臟有一定的保護(hù)作用。

證據(jù)表明,炎癥可參與多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。TLR4/NF-κB信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌參與心肌損傷的病理生理過程〔12〕。TLR4通過一系列信號(hào)分子激活NF-κB,進(jìn)而促進(jìn)IL-6,TNF-α、TAK1等炎癥因子的分泌增加,損傷心肌組織。減少炎癥通路中相關(guān)蛋白和炎癥因子的表達(dá),在心肌損傷的治療中發(fā)揮非常重要的作用。本研究結(jié)果說明,炎癥參與了ApoE-/-小鼠心臟損傷,SABP可以顯著降低模型組心肌組織中TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α和TAK1等蛋白的表達(dá),說明SABP可通過下調(diào)TLR4/NF-κB通路的關(guān)鍵蛋白表達(dá),減少炎癥因子的分泌,進(jìn)而減輕ApoE-/-小鼠心臟的損傷。

綜上,丹參四種水溶性成分的有效組合SABP具有降低ApoE-/-小鼠血脂、減輕心臟損傷的作用,其機(jī)制可能與調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。本研究為SABP治療心血管疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。