田清華 孫培帥 劉霞 金其貫 胡潤東

(1湖南師范大學(xué)體育學(xué)院,湖南 長沙 410012;2揚(yáng)州大學(xué)體育學(xué)院;3聊城幼兒師范學(xué)校)

糖尿病是由于胰島素分泌缺陷或作用障礙所致的,以高血糖為特征的代謝性疾病,可由多種細(xì)胞和分子途徑異常引發(fā)。機(jī)體長期處于高血糖環(huán)境,可引發(fā)多種組織,特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害及功能障礙〔1〕。Brownlee〔2〕認(rèn)為機(jī)體長時(shí)間處于高糖的刺激下,會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的氧化應(yīng)激,進(jìn)而引起組織損傷。血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)是維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要屏障,其結(jié)構(gòu)缺陷和功能障礙是各種心血管疾病產(chǎn)生的病理基礎(chǔ)。糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙主要由氧化應(yīng)激與炎癥引起,引起途徑主要是一氧化氮(NO)生產(chǎn)障礙和NO激活障礙〔3〕。劉菊等〔4〕研究表明,機(jī)體的血同型半胱氨酸(Hcy)產(chǎn)生過多時(shí),會(huì)降低機(jī)體的抗氧化能力,影響血管內(nèi)皮細(xì)胞正常代謝,進(jìn)而破壞內(nèi)皮細(xì)胞的功能發(fā)揮,加速了微血管病變的進(jìn)程。

網(wǎng)膜素(omentin)是近年發(fā)現(xiàn)的新型特異性脂肪因子,實(shí)驗(yàn)表明omentin-1在維持能量代謝平衡,提高胰島素致敏性,抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)和降低心血管發(fā)病概率等扮演關(guān)鍵角色。omentin通過不同調(diào)節(jié)機(jī)制參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和增加NO的生成。就內(nèi)皮功能而言,網(wǎng)膜蛋白可通過激活一氧化氮合酶(eNOS)加強(qiáng)血管舒張功能,并且可以經(jīng)omentin-1/三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ABC)A1途徑,降低主動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展〔5〕。omentin水平與內(nèi)皮功能之間有很大的關(guān)系,特別是高危糖尿病患者,omentin對(duì)內(nèi)皮功能障礙具有顯著性保護(hù)作用〔6〕。Wang等〔7〕指出,omentin可以促進(jìn)eNOS的表達(dá),刺激蛋白激酶B(Akt)-eNOS信號(hào)通路,機(jī)體NO的生成增加,從而促進(jìn)缺血反應(yīng)中的內(nèi)皮細(xì)胞功能和血運(yùn)重建能力。Liu等〔8〕指出,omentin-1通過抑制氧化應(yīng)激并通過激活腺苷酸活化蛋白激酶/過氧化物酶體增殖物激活受體(AMPK/PPAR)γ途徑增加NO的產(chǎn)生來預(yù)防高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙。

研究表明,12 w有氧運(yùn)動(dòng)可以明顯降低體重和胰島素抵抗,同時(shí)omentin表達(dá)水平顯著提高〔9〕。有氧運(yùn)動(dòng)是否通過增加omentin來改善糖尿病血管內(nèi)皮功能,其機(jī)制又如何。本研究將探討糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能、有氧運(yùn)動(dòng)及omentin之間的關(guān)系及在運(yùn)動(dòng)干預(yù)下omentin/AMPK/eNOS通路對(duì)糖尿病血管內(nèi)皮的作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組與建模 將40只6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠,每籠5只分籠飼養(yǎng)。光照為自然光,環(huán)境溫度濕度適宜,并每天早上更換墊料。保持動(dòng)物房通風(fēng)、干凈。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂食3 d,喂養(yǎng)結(jié)束后將大鼠隨機(jī)分為2組,分別為對(duì)照組(NC組,n=10)和糖尿病建模組(DM組,n=30)。 對(duì)照組用普通飼料進(jìn)行喂養(yǎng),糖尿病建模組用高脂質(zhì)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)(配合:基礎(chǔ)飼料占比72.5%,豬油占比12%,蔗糖占比9%,大豆粉末占比3%,膽固醇占比2%,膽汁鹽占比1.5%)。進(jìn)行4 w飼養(yǎng)后,糖尿病建模組的大鼠進(jìn)行12 h的禁食,并且在腹部注射鏈尿佐菌素(STZ)溶液40 mg/kg。1 w后測(cè)定糖尿病組大鼠尾靜脈中的血糖濃度,血糖濃度>11.1 mol/L,而且明顯出現(xiàn)三多一少的癥狀,說明成功建立了糖尿病組的模型。一共有27只大鼠建模成功,將建模成功后27只大鼠分為糖尿病對(duì)照組(DMC組,n=9)和糖尿病運(yùn)動(dòng)組(DME組,n=18),DME組實(shí)施設(shè)計(jì)好的運(yùn)動(dòng)方案進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)。

1.2運(yùn)動(dòng)方案 糖尿病運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間為8 w,訓(xùn)練內(nèi)容為無負(fù)重游泳訓(xùn)練,每周進(jìn)行6 d的訓(xùn)練,訓(xùn)練時(shí)間為1 h/次,在方案執(zhí)行過程中應(yīng)注意:(1)觀察大鼠運(yùn)動(dòng)中狀態(tài),防止大鼠溺亡。(2)保持泳池衛(wèi)生和最佳溫度,為大鼠運(yùn)動(dòng)提供適宜環(huán)境。每周大鼠休息日測(cè)體質(zhì)量、快速血糖儀測(cè)血糖以備統(tǒng)計(jì)。

1.3動(dòng)物取材及處理 大鼠最后一次運(yùn)動(dòng)后,禁食不禁水。第二天(12 h后)將大鼠進(jìn)行麻醉注射,注射完成后對(duì)大鼠的靜脈進(jìn)行取血。取血完成后,將取得的血液放入血清促凝管中進(jìn)行靜置保存,保存時(shí)間為30 min,30 min后將血液進(jìn)行離心操作,隨后吸取血清并將其保存在-20 ℃冰箱,用來準(zhǔn)備測(cè)量血液中的各項(xiàng)指標(biāo)〔空腹血糖(FBG)、omentin、NO、血清胰島素(INS)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)〕。取2 cm干凈胸主動(dòng)脈血管組織放入2.8%的戊二醛溶液中固定,以備后期電鏡掃描。另取胸主動(dòng)脈血管組織長度為2 cm,并將其固定放入10%的甲醛溶液中,目的是準(zhǔn)備蘇木素-伊紅(HE)染色。將余下的主動(dòng)脈組織保存在溫度為-80 ℃的冰箱內(nèi),目的是準(zhǔn)備用來測(cè)蛋白、mRNA和含量。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=INS×FBG/22.5。

1.4血管組織HE染色 采集固定的胸主動(dòng)脈血管組織并脫水,用包埋機(jī)包埋蠟浸過的組織,制造蠟并冷卻。冷卻結(jié)束后修正冷卻后的蠟塊,隨后將蠟塊進(jìn)行切片、撈片,最后用烘干箱將其烘干,用來準(zhǔn)備進(jìn)行HE染色。經(jīng)過洗脫、透明、封片后鏡下觀察其顯微結(jié)構(gòu)并攝影,觀察其血管內(nèi)皮組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.5血管組織掃描電鏡觀察 取完大鼠血液,用棉球?qū)⒏骨贿z留血液擦拭干凈后,取米粒大小胸主動(dòng)脈血管組織,馬上將其放入提前準(zhǔn)備好的2.8%戊二醛中,環(huán)境溫度為4 ℃,固定時(shí)間為2 h以上。在此之前2.8%戊二醛固定2 h以上,4 ℃冰箱,用0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)來清洗,一共將其清洗3～4次,每次的清洗時(shí)間為15 min,隨后1%的鵝酸固定2 h,用0.1 mmol/L PBS來清洗,共將其清洗3～4次,每次的清洗時(shí)間為15 min,隨后放入乙醇中進(jìn)行梯度脫水,其中乙酸乙戊酯與乙醇比例為1∶1,梯度脫水時(shí)間為0.5 h,隨后將其放入純乙酸乙戊酯中時(shí)間為0.5 h,接下來進(jìn)行CO2臨界點(diǎn)干燥、黏樣、鍍膜等步驟,完成后將其放在鏡下進(jìn)行觀察。

1.6大鼠血清指標(biāo)測(cè)試 血清中FBG含量用葡萄糖氧化酶法測(cè)定,血清中NO含量用硝酸還原酶法測(cè)定,血清中HDL、LDL、TC、TG含量用分光光度法測(cè)定。

1.7大鼠胸主動(dòng)脈omentin、AMPK、 eNOS 、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量的測(cè)定 采用二喹啉甲酸(BCA)方法測(cè)定大鼠胸主動(dòng)脈總蛋白濃度。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)試血清胰島素、胸主動(dòng)脈組織中omentin、ΑMPK和eNOs含量。實(shí)驗(yàn)過程:準(zhǔn)備預(yù)包被微板,依次加入大鼠蛋白,標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行孵育,隨后加入抗體生物素,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體在孵育完全后加入,隨后進(jìn)行徹底的洗滌。最后發(fā)現(xiàn)洗滌后的樣板底物在過氧化酶和酸的作用下顯現(xiàn)出黃色,放入酶標(biāo)儀中,以波長450 nm進(jìn)行OD值測(cè)定并計(jì)算樣品濃度。

1.8大鼠主動(dòng)脈組織中c-Jun氨基末端激酶(JNK)mRNA、環(huán)氧化酶(Cox)-2 mRNΑ的測(cè)定 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測(cè)主動(dòng)脈組織JNK mRNA、Cox-2 mRNΑ,從大鼠主動(dòng)脈中提取總RNA,吸光度值用分光光度計(jì)測(cè)定,測(cè)定完成后計(jì)算相對(duì)濃度,判斷所提取RNA純度。PCR儀(美國)中,cDNA的合成過程嚴(yán)格按照cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行合成,合成后的cDNA的保存條件為-20 ℃。以cDNA為模板,以GAPDH為內(nèi)參,在PCR儀中反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,計(jì)算得到目的基因Ct值的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

在上海生物工程有限公司選購JNK、Cox-2 的引物,引物序列:JNK上游引物:TCCCAGTCTTCGATGCTCTT 50%GC〔指引物的堿基充列中含有鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)堿基的百分比〕,引物的溶解溫度(M)59.27 ℃、下游:TTACAAGCCAGGTGTGAACG 50%GC,M 60.13 ℃,COX-2上游引物:CTGGAAACCTAGCACCTTCG 50%GC,M 60.65 ℃、下游:TGAAAGAGGCAAAGGGACAC 50%GC,M 60.00 ℃,GAPDH上游引物:ACAGCAACAGGGTGGTGGAC 60%GC,M 60.62 ℃、下游:TTTGAGGGTGCAGCGAACTT 50%GC,M 60.47 ℃。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.13組血清FBG、INS及HOMA-IR 與NC組比較,DMC組血清FBG和HOMA-IR水平顯著增加(P<0.05),血清INS水平無明顯變化(P>0.05);與DMC組比較,DME組血清FBG水平顯著下降(P<0.05),見表1。

表1 各組血清FBG、INS、HOMA-IR、TG、TC、HDL、LDL含量比較

2.2各組血清中血脂的變化 與NC組比較,DMC組血清TG,TC均顯著升高(P<0.05);與DMC組比較,DME組血清TG水平顯著降低(P<0.05),見表1。

2.3各組血清NO、主動(dòng)脈eNOS含量的變化 與NC組比較,DMC組NO、eNOs水平均顯著下降(P<0.05,P<0.01);與DMC組比較,DME組NO、eNOS含量均顯著增加(P<0.05),見表2。

表2 各組血清NO、主動(dòng)脈組織eNOS含量的變化

2.43組主動(dòng)脈HE染色、掃描電鏡下觀察結(jié)果 通過HE染色觀察血管內(nèi)皮發(fā)現(xiàn),NC組血管內(nèi)皮細(xì)胞光滑,組織排列緊密,細(xì)胞核排列整齊分布均勻。DMC組血管內(nèi)皮的組織出現(xiàn)疏松現(xiàn)象,并且出現(xiàn)了不同程度的隆起。DME組與DMC組相比其血管內(nèi)皮的隆起部分有所減小,血管內(nèi)皮組織排列較緊密,細(xì)胞核的分布形態(tài)呈線狀。 通過掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn),NC組血管內(nèi)皮表面光滑平整、結(jié)構(gòu)清晰,可觀測(cè)到少量微絨毛;細(xì)胞飽滿,充滿光澤,呈條帶狀有序分布;細(xì)胞間形態(tài)和大小基本一致,且界限明晰,連接緊密。DMC組內(nèi)皮形態(tài)顯著異常,在內(nèi)皮表面出現(xiàn)褶皺,并且其結(jié)構(gòu)雜亂,內(nèi)皮表面絨毛也已消失;內(nèi)皮細(xì)胞萎靡,沒有光澤,紊亂排列且間隙增大;表面可觀測(cè)到明顯的細(xì)胞膜缺損及附著在表皮上脫落的細(xì)胞碎片和纖維。DME組內(nèi)皮表面形態(tài)出現(xiàn)異常但不明顯,膜表面結(jié)構(gòu)及排序混亂無序,褶皺部分不明顯,有些許的細(xì)胞碎片附著在細(xì)胞表面,隱約可見表面微絨毛。見圖1。

圖1 各組主動(dòng)脈血管形態(tài)

與NC組比較:1)P<0.05,2)P<0.01;與DMC組比較:3)P<0.05,4)P<0.01

2.5各組血清和主動(dòng)脈血管網(wǎng)膜素及AMPK含量 與NC組比較,DMC組血清omentin水平、血管omentin表達(dá)水平、主動(dòng)脈血管AMPK含量均顯著下降(P<0.05,P<0.01);與DMC組比較,DME組血清和組織omentin水平及AMPK含量均顯著升高(P<0.05),見表2。

2.6各組主動(dòng)脈組織TNF-α含量、JNK、Cox-2 mRNΑ表達(dá) 與NC組比較,DMC組TNF-α含量、JNK、Cox-2 mRNΑ表達(dá)量均顯著升高(均P<0.01);與DMC組比較,DME組TNF-α含量、JNK、Cox-2 mRNΑ表達(dá)量顯著降低(P<0.05,P<0.01),見表2。

3 討 論

血管內(nèi)皮在受到生物體的血糖、血脂代謝異常產(chǎn)物和炎癥因子等有害物質(zhì)的刺激,其穩(wěn)態(tài)會(huì)受到破壞,進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙〔10〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是產(chǎn)生糖尿病及其并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)〔11〕。臨床和基礎(chǔ)研究表明,糖尿病合并并發(fā)癥的產(chǎn)生是由于糖尿病患者機(jī)體糖脂代謝異常導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),進(jìn)而引起血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌內(nèi)皮依賴性調(diào)節(jié)蛋白失衡從而造成大血管、微血管病變〔12〕。Babbitt等〔13〕發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)能有效改善T2DM血管內(nèi)皮功能障礙、提高機(jī)體胰島素敏感性、降低糖尿病心血管并發(fā)癥發(fā)生概率。本實(shí)驗(yàn)研究表明,8 w有氧運(yùn)動(dòng)后,DME組主動(dòng)脈血管內(nèi)皮輕微隆起,表皮附著些許碎片,組織厚度減小;細(xì)胞核排列緊湊,細(xì)胞之間間隙變小,較DMC組均有所改善。

糖尿病產(chǎn)生內(nèi)皮功能障礙的主要因素之一就是血管舒張因子NO的生物-合成減少〔14～16〕。eNOS通過介導(dǎo)NO的合成,進(jìn)而參與血管內(nèi)皮形態(tài)和功能的調(diào)節(jié)。正常生理狀態(tài)下,機(jī)體內(nèi)NO主要受內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS及其上游因子調(diào)節(jié)〔17〕。在病理狀態(tài)下,由于氧化應(yīng)激等各種原因會(huì)解耦eNOs合成NO路徑且直接滅活NO,而運(yùn)動(dòng)可通過蛋白磷酸化機(jī)制提高機(jī)體eNOs的表達(dá),從而平衡NO的產(chǎn)生與利用〔18〕。研究發(fā)現(xiàn),在高血糖,高血脂等影響下,2型糖尿病患者的eNOS磷酸化水平降低,內(nèi)源性NO釋放受到抑制,造成血管舒縮兩端失衡,內(nèi)皮通透性改變,進(jìn)而引起血管內(nèi)皮功能紊亂〔19～21〕。張鵬程等〔22〕通過研究發(fā)現(xiàn):在進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合抗阻運(yùn)動(dòng)干預(yù)8 w后,顯著增加eNOS表達(dá)量,促進(jìn)NO、VEGF的分泌。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,長期的有規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)可增加eNOS和NO的含量,從而保護(hù)血管內(nèi)皮功能。

omentin是一個(gè)在內(nèi)臟脂肪組織中選擇性高表達(dá)的新型脂肪源性脂肪因子,omentin可以分為omentin-1和omentin-2,通過研究發(fā)現(xiàn),omentin-1在血液循環(huán)中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于omentin-2〔23〕。omentin具有抑制炎癥反應(yīng)、抑制胰島素的敏感性等作用。omentin不僅通過調(diào)節(jié)血管功能和降低環(huán)氧合酶-2的表達(dá)來抑制血管炎癥,還參與了糖脂代謝的能量轉(zhuǎn)換過程〔24〕。有研究發(fā)現(xiàn),omentin可以有效反映血管內(nèi)皮功能是否發(fā)生障礙,可以作為測(cè)試內(nèi)皮功能的生物指標(biāo)〔25〕。張霞〔26〕研究發(fā)現(xiàn),糖尿病患者體內(nèi)血漿omentin水平顯著降低與本研究結(jié)果一致。

omentin-1的內(nèi)皮保護(hù)作用通過調(diào)節(jié)NO實(shí)現(xiàn)的,omentin可增加皮瓣成活面積百分比、表皮厚度、新生血管數(shù)量、eNOS活性〔27〕。有研究發(fā)現(xiàn)大鼠血管omentin重組后,omentin/eNOS/NO通路可以改善大鼠血管舒張功能障礙〔28〕。Xu等〔29〕和Kazama等〔30〕發(fā)現(xiàn),在體內(nèi)外,omentin-1可誘導(dǎo)AMPK和Akt的活化,一方面通過AMPK/Akt信號(hào)通路抗動(dòng)脈鈣化,另一方面omentin可通過AMPK/NO信號(hào)通路,使血管舒張彈性得以增加,血管舒縮平衡得以改善。TNF-α水平在糖尿病小鼠的心臟的血管系統(tǒng)的內(nèi)皮增加,已被鑒定為沉淀血管功能障礙的關(guān)鍵介導(dǎo)物。omentin可以通過AMPK/eNOS/NO途徑從而減輕炎癥反應(yīng),糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程從而得到延緩〔31〕。Yamawaki等〔32〕認(rèn)為,omentin可以激活蛋白激酶/eNOS信號(hào)通路從而來抑制JNK、TNF-α等炎性因子的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)也表明,omentin水平和AMPK、eNOS水平呈正相關(guān),因此能夠促進(jìn)NO的產(chǎn)生,改善內(nèi)皮功能障礙。另外,NO與JNK、TNF-α含量呈顯著負(fù)相關(guān)。通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),DMC組大鼠血管中omentin的表達(dá)水平明顯低于NC組大鼠和DME組大鼠,AMPK和eNOS水平隨著糖尿病血管內(nèi)皮病變的程度相應(yīng)減少。推測(cè),在糖尿病血內(nèi)皮功能的變化過程中,omentin與AMPK/eNOS/NO通路有很大的關(guān)系,并與阻止JNK通路、抑制TNF-α誘導(dǎo)的炎癥有關(guān)。

耐力訓(xùn)練或飲食干預(yù)后,網(wǎng)膜蛋白和心臟代謝特性得到了改善〔25〕。因此,可以認(rèn)為網(wǎng)膜蛋白由于體重減輕或肥胖相關(guān)因素的改善而增加。Madsen等〔33〕證明,每周進(jìn)行8次劇烈運(yùn)動(dòng)和中度運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)卵巢切除大鼠的血清網(wǎng)膜蛋白增加。周琳等〔34〕實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),有氧聯(lián)合抗阻訓(xùn)練能夠改善糖尿病病癥,與此同時(shí),血清omentin的水平呈顯著性升高,提示有氧運(yùn)動(dòng)改善糖尿病病癥可能與血清omentin水平升高有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),在對(duì)肥胖大鼠進(jìn)行8 w游泳訓(xùn)練后,大鼠體質(zhì)量與血清omentin呈現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān),大鼠omentin水平呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)〔35〕。Nikseresht等〔36〕也證實(shí),NRT和AIT不同程度的促進(jìn)omentin-1的分泌進(jìn)而降低心臟代謝的危險(xiǎn)因素。omentin幾乎參與了整個(gè)2型糖尿病發(fā)病及血管內(nèi)皮病變的全過程,而有氧運(yùn)動(dòng)可以通過刺激omentin的分泌改善糖尿病血管并發(fā)癥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,omentin可能通過AMPK/eNOS通路來促進(jìn)舒血管因子NO的分泌,TNF-α、JNK等炎性因子的激活得到抑制,抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生及氧化應(yīng)激反應(yīng),達(dá)到改善糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙的作用。