鄧秋媚 向軍軍 吳林 莫雪妮 陳煒 黎軍宏 胡躍強(qiáng)

(1廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530200;2廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

血管性癡呆(VaD)的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,目前認(rèn)為腦血管病變是導(dǎo)致VaD認(rèn)知障礙的主要環(huán)節(jié)〔1〕。突觸可塑性是認(rèn)知功能的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ),在神經(jīng)損傷修復(fù)及學(xué)習(xí)和記憶中起著重要的作用〔2〕。研究證實(shí),Nogo受體(NgR)能和3種主要髓鞘抑制蛋白:髓磷脂相關(guān)抑制物(Nogo-A)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(OMgp)結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)其下游Ras基因家族成員(Rho)A/Rho相關(guān)激酶(ROCK)信號(hào)途徑,抑制軸突再生〔3〕,成為影響神經(jīng)元生長(zhǎng)的重要因素,是防治VaD發(fā)病及治療干預(yù)的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。本研究采用腺相關(guān)病毒(AAV)基因干擾技術(shù)表達(dá)短發(fā)夾架構(gòu)RNA(shRNA)抑制NgR/RhoA/ROCK2信號(hào)通路,觀察其對(duì)VaD大鼠的影響。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠40只,3月齡,體質(zhì)量(250±50)g,由湖南斯萊克景達(dá)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK湘2019-0004。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組:假手術(shù)組、模型組、NgR干擾組(腺相關(guān)病毒)、陰性對(duì)照組(NgR空載體病毒),每組各10只。

1.2藥物制備及主要儀器試劑 ①實(shí)驗(yàn)藥物:AAV9-NgR-shRNA注射液及空載體病毒(上海吉滿生物科技有限公司制造)。②主要儀器及試劑:引物及內(nèi)參(天根生物科技有限公司);二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、β-actin抗體(碧云天生物公司);兔抗NgR多克隆抗體、兔抗RhoA多克隆抗體、兔抗ROCK2單克隆抗體均購自美國Abcam公司;MT-200型Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司);HM355S型全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(德國MICROM);聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(ABI公司,型號(hào)7500);水平電泳儀(北京六一儀器廠,型號(hào)DYCP-31DN);半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)(ATTO公司,型號(hào)WSE-4040)。

1.3實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽浼八幬锔深A(yù) 參照文獻(xiàn)制備VaD大鼠模型〔4〕,評(píng)估模型成功后,將AAV-NgR-shRNA原液稀釋至3.26×1012vg/ml,采用腦立體定位儀將其注入海馬組織,每只動(dòng)物注射總量4 μl,持續(xù)5 min;陰性對(duì)照組注射等量空載體病毒。術(shù)后各組正常喂養(yǎng),觀察4 w。

1.4指標(biāo)觀察

1.4.1學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)定 ①定位航行實(shí)驗(yàn):術(shù)后第1周、第4周,每組大鼠每天上下午從4個(gè)象項(xiàng)各訓(xùn)練一次,將大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間設(shè)置為120 s,記錄大鼠從入水到爬上平臺(tái)所需時(shí)間,即逃避潛伏期,作為大鼠空間學(xué)習(xí)能力的檢測(cè)指標(biāo)。②空間搜索實(shí)驗(yàn):大鼠完成定位航行實(shí)驗(yàn)后,于術(shù)后第1周、4周進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn),撤走平臺(tái),依次將大鼠從4個(gè)象限放入水中,分別記錄其跨越原來平臺(tái)的次數(shù),作為空間記憶的檢測(cè)指標(biāo)。

1.4.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)NgR、RhoA、ROCK2 mRNA表達(dá) 海馬組織總RNA運(yùn)用Trizol法提取,提取完成后取2 μg RNA開始逆轉(zhuǎn)錄,引物由天根生物科技有限公司設(shè)計(jì)并提供。引物序列:β-actin上游引物:5′-GCGCAAGTACTCTGTGTGG-3′,下游:5′-AGGGTGTAAAACGCAGCTCAG-3′;NgR上游引物:5′-AATGCACTCAAGGGAC-GTGT-3′,下游:5′-CTACGGGTGCGGTTCTTTCT-3′;RhoA上游引物:5′-AGGATTGGCGCTTTTGGGTA-3′,下游:5′-TTC-ACAAGATGAGGCACCCC-3′;ROCK2上游引物:5′-ACAA-ACCAAGCTAACTGCCT-3′,下游:5′-CTACGGGTGCGGTTCTTTCT-3′。逆轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增條件如下:94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性30 s,48 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共40個(gè)循環(huán),最后完成72 ℃總延伸5 min,每組各取5 μl PCR產(chǎn)物電泳,凝膠成像儀獲取圖像,以2-ΔΔCt法對(duì)樣本基因進(jìn)行表達(dá)差異相對(duì)定量分析。

1.4.3Western印跡檢測(cè)NgR、RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)水平 按說明書提取各組海馬組織蛋白,用BCA試劑盒測(cè)定并調(diào)整每個(gè)樣本蛋白濃度之后上樣。連接電泳裝置及電源,電壓設(shè)為120 V恒壓,1.5 h后停止電泳,用封閉液〔含5%脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)溶液〕室溫封閉膜2 h,用新配制的封閉液稀釋抗體 4 ℃孵育過夜。用封閉液稀釋各蛋白一抗對(duì)應(yīng)的二抗,室溫下孵育膜1 h,用PBST洗膜用于圖像采集。加電化學(xué)發(fā)光(ECL)工作液,在凝膠成像儀下曝光成像,采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析,獲取各組Western印跡條帶的平均光密度(OD)值,內(nèi)參為β-actin,目的蛋白與內(nèi)參光密度比值即為目的蛋白的相對(duì)值。

1.4.4透射電鏡觀察海馬病理變化 大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,迅速取出腦組織,取2 mm×2 mm×2 mm大小的右側(cè)海馬CA1區(qū)組織1塊,置于2.5%戊二醛預(yù)固定然后入1%鋨酸繼續(xù)固定,經(jīng)70%、80%、95%乙醇、無水丙酮脫水,環(huán)氧樹脂Epon812浸透和包埋,全自動(dòng)石蠟切片機(jī)超薄切片,厚度約4 μm,3% 醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色,透射電子顯微鏡觀察海馬組織的結(jié)構(gòu)變化。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,組間比較方差齊者用LSD檢驗(yàn),方差不齊者用TamhaneT2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組行為學(xué)檢測(cè) 術(shù)前各組潛伏期及跨越平臺(tái)次數(shù)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);術(shù)后1 w,模型組、陰性對(duì)照組與NgR干擾組潛伏期與跨越平臺(tái)次數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與假手術(shù)組比較有顯著性差異(P<0.01,P<0.05);術(shù)后4 w,與假手術(shù)組比較,模型組與陰性對(duì)照組潛伏期及跨越平臺(tái)次數(shù)差異顯著(P<0.01,P<0.05),與模型組及陰性對(duì)照組比較,NgR干擾組潛伏期顯著縮短、跨越平臺(tái)次數(shù)顯著增加(P<0.05),陰性對(duì)照組潛伏期與跨越平臺(tái)次數(shù)較模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)比較

2.2各組NgR/RhoA/ROCK2通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化 與假手術(shù)組比較,模型組及陰性對(duì)照組NgR、RhoA、ROCK2 mRNA表達(dá)量明顯升高(P<0.01);與模型組及陰性對(duì)照組比較,NgR干擾組以上指標(biāo)顯著下降(均P<0.05),模型組與陰性對(duì)照組上述指標(biāo)無明顯變化(均P>0.05)。見表2。

表2 各組NgR、RhoA、ROCK2 mRNA及蛋白表達(dá)

2.3各組NgR/RhoA/ROCK2通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化 與假手術(shù)組比較,模型組及陰性對(duì)照組NgR、RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01);與模型組及陰性對(duì)照組比較,NgR干擾組上述指標(biāo)顯著下降(P<0.05),模型組與陰性對(duì)照組上述指標(biāo)蛋白表達(dá)量無明顯變化(P>0.05)。見表2、圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)各組海馬組織NgR、RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)

2.4電鏡觀察大鼠海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu)變化 假手術(shù)組突觸結(jié)構(gòu)正常且清晰,突觸前膜有大量球形突觸小泡,可見清晰的線粒體,突觸間隙寬度及形態(tài)正常,突觸后膜厚度正常且均勻;模型組與陰性對(duì)照組突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清晰,突觸小泡分布零散且形態(tài)模糊;NgR干擾組突觸結(jié)構(gòu)清晰,前膜和后膜形態(tài)正常,可見清晰的線粒體結(jié)構(gòu),突觸間隙寬度正常。見圖2。

圖2 各組海馬電鏡下超微結(jié)構(gòu)比較(×10 000)

3 討 論

VaD的病因涉及神經(jīng)元、軸突和突觸部位的某些神經(jīng)遞質(zhì)、受體、蛋白激酶等多種物質(zhì)的變化〔5〕。研究證實(shí),抑制Rho/ROCK2傳導(dǎo)通路,可減少神經(jīng)元損傷,促進(jìn)缺損神經(jīng)功能的恢復(fù),已成為治療中樞神經(jīng)損傷藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)〔6,7〕。NogoA作為重要的軸突抑制因子,與其受體NgR結(jié)合后激活RhoA/ROCK信號(hào)通路傳遞,影響肌動(dòng)-肌球蛋白系統(tǒng),導(dǎo)致生長(zhǎng)錐塌陷,從而抑制中樞神經(jīng)軸突再生〔8〕。正常情況下中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)NogoA的表達(dá)量較少,當(dāng)中樞受損后,NogoA/NgR 的表達(dá)上調(diào),而其主要作用是抑制損傷后神經(jīng)重塑和修復(fù)〔9,10〕。大量研究證明,使用抗NogoA抗體〔11〕或阻斷NgR表達(dá)〔12〕,都可抑制Rho/ROCK2信號(hào)通路傳導(dǎo),促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生和功能恢復(fù)。

已知Nogo是一個(gè)堿性磷酸酶融合蛋白,它和軸突表面蛋白結(jié)合后,通過跨膜的協(xié)同受體形成受體復(fù)合物,將抑制性信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi),從而抑制軸突的再生〔13〕。因此它是整個(gè)抑制環(huán)節(jié)的中樞,將其阻斷有可能促進(jìn)中樞神經(jīng)損傷后軸突的再生。有研究采用抑制劑肽(PN1-40)及NgR(310)Ecto-Fc方法治療大鼠脊髓橫斷損傷和缺血性腦損傷后,能夠明顯改善軸突再生,恢復(fù)受損的運(yùn)動(dòng)功能〔14,15〕。然而,這些拮抗劑的治療效果很大程度上依賴于其傳遞途徑,而且需要長(zhǎng)期的給藥,難以達(dá)到穩(wěn)定的血藥濃度。如果能從基因水平抑制NgR的表達(dá)水平,將可能取得更佳的效果。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用siRNA能高效阻斷某個(gè)特定基因的表達(dá),特別用于阻斷某些突變基因的表達(dá),或由蛋白表達(dá)過量引起的疾病。使用腺相關(guān)病毒載體表達(dá)短發(fā)夾架構(gòu)RNA(shRNA)能夠長(zhǎng)效敲低基因,具有特異、高效等優(yōu)點(diǎn),且通過血腦屏障效率高,正成為基因敲低實(shí)驗(yàn)的第一選擇,近年來逐漸成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的新熱點(diǎn)〔16〕。

綜上,腺病毒介導(dǎo) RNAi 可以明顯降低VaD大鼠海馬NgR表達(dá)水平,并可能通過抑制Rho/ROCK信號(hào)通路的傳導(dǎo),促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突的生長(zhǎng)及神經(jīng)元的修復(fù),從而改善認(rèn)知功能,其機(jī)制值得進(jìn)一步探索。