房斌 王鵬 李守川 矯學黎

(青島大學附屬青島市海慈醫(yī)院 青島市中醫(yī)醫(yī)院 1肛腸科,山東 青島 266033;2普外科)

我國是胃癌的高發(fā)地區(qū),每年新發(fā)胃癌患者約為40萬,其中以老年患者為主〔1〕,患者5年生存率僅為40%～50%,明顯低于歐美發(fā)達國家的70%以上〔2〕。淋巴結轉移是胃癌患者不良預后的主要原因之一,術前準確評估胃癌患者淋巴結轉移風險,對手術方式選擇和確定淋巴清掃范圍具有重要意義〔3〕。整合素β6參與胰腺癌、膽管癌等多種惡性腫瘤的發(fā)病機制,在腫瘤組織中表達明顯上調,且與患者的中位生存期密切相關〔4〕。同源異型盒基因轉錄因子(Prox)-1、脂肪非典型鈣黏蛋白(FAT)4與腫瘤淋巴管新生和腫瘤細胞轉移密切相關〔5〕,但關于老年胃癌患者的研究仍較為少見。本研究探討老年胃癌患者血清整合素β6和組織中Prox-1、FAT4表達變化及對淋巴結轉移的預測價值。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2020年4月至2021年11月青島大學附屬青島市海慈醫(yī)院收治的老年胃癌患者80例為胃癌組。入選標準:①年齡≥60歲,經組織病理學檢查確診為胃癌;②有手術適應證,自愿接受胃大部根治性切除聯合淋巴結清掃術治療;③臨床和病理資料完整。排除標準:①術前有放療、化療、靶向藥物等抗腫瘤治療史;②出現嚴重手術并發(fā)癥;③存在其他異源性惡性腫瘤。男42例,女38例;年齡61～78歲,平均(67.24±4.81)歲;胃癌病灶位置:胃體45例,胃底賁門16例,胃底幽門19例。另選取老年健康志愿者48例為對照組,均無惡性腫瘤、重要系統、臟器功能嚴重異常,男26例,女22例;年齡60～73歲,平均(66.48±3.27)歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準,患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑 整合素β6酶聯免疫檢測試劑盒購于深圳科潤達生物工程有限公司;Prox-1、FAT4免疫組化檢測試劑盒(Elivison二步法)購于北京百奧萊博科技有限公司;3,3′-二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購于北京中科瑞泰生物有限公司。

1.3標本采集與處理 胃癌組術前、對照組體檢時分別采集空腹肘靜脈血4 ml,室溫下2 500 r/min離心10 min,將血清轉移至乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,-80 ℃保存,以備檢測血清整合素β6濃度。術中采集胃癌患者胃癌組織標本和癌旁正常組織標本,放入液氮中快速凍存。

1.4血清整合素β6濃度檢測 取胃癌組和對照組血清標本,采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗檢測血清整合素β6濃度,酶標儀讀取450 nm處的吸光度值,帶入標準品繪制得到的標準曲線,計算得出整合素β6濃度。

1.5組織標本中Prox-1、FAT4表達檢測 取胃癌組織和癌旁正常組織標本,10%甲醛溶液固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明,常規(guī)石蠟包埋,5 μm切片后行免疫組化染色。操作如下:將組織切片脫蠟至水,熱修復抗原,室溫下使用磷酸緩沖液處理切片,去除內源性過氧化物酶活性,血清封閉。滴加兔抗人Prox-1多克隆抗體(1∶800倍稀釋)、鼠抗人FAT4單克隆抗體(1∶300倍稀釋),4 ℃冰箱中放置過夜,磷酸緩沖液沖洗后滴加生物素標記的二抗,1∶3 000倍稀釋,恒溫箱中靜置30 min,溫度調至37 ℃,使用DAB顯色試劑盒顯色,蘇木素復染、封片。由病理科醫(yī)師在光學顯微鏡下讀片,根據陽性細胞比例和染色強度判斷綜合判斷。陽性細胞比例:<25%、25%～49%、50%～74%、75%～100%分別計1～4分;染色強度:無色、黃色、黃褐色、褐色分別計0～3分。陽性細胞比例與染色強度的乘積0～4分為陰性,5～12分為陽性。

1.6統計學分析 采用SPSS25.0軟件進行方差分析、t檢驗、χ2檢驗及受試者工作特征(ROC)曲線分析。

2 結 果

2.1兩組血清整合素β6濃度比較 胃癌組血清整合素β6濃度(3.96±0.51)明顯高于對照組(0.28±0.04;t=25.738,P=0.000)。

2.2不同組織中Prox-1、FAT4表達 胃癌組織中Prox-1表達陽性率〔48例(60.00%)〕明顯高于癌旁正常組織〔11例(13.75%),χ2=37.948,P=0.000〕,FAT4表達陽性率〔51例(63.75%)〕明顯低于癌旁正常組織〔76例(95.00%),χ2=44.071,P<0.01〕。

2.3不同臨床病理特征的老年胃癌患者血清整合素β6濃度、Prox-1、FAT4陽性表達比較 TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤直徑>4 cm、分化程度未分化或低分化、有淋巴結轉移的老年胃癌患者血清整合素β6濃度、Prox-1、FAT4陽性表達與TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、腫瘤直徑≤4 cm、分化程度中分化或高分化、無淋巴結轉移的患者差異顯著(P<0.001)。上述指標在不同性別、年齡、腫瘤位置、病理類型的老年胃癌患者之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征胃癌患者血清整合素β6濃度及Prox-1、FAT4陽性表達比較

2.4血清整合素β6及組織中Prox-1、FAT4表達對老年胃癌患者淋巴結轉移的預測價值 血清整合素β6及組織中Prox-1、FAT4表達水平單獨和聯合檢測對老年胃癌患者淋巴結轉移均具有較高的預測價值(P<0.05);其中血清整合素β6及組織中Prox-1、FAT4表達水平聯合檢測的預測價值最高〔曲線下面積(AUC)=0.941〕,特異度和陽性預測值明顯高于各指標單獨檢測(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 血清整合素β6及組織中Prox-1、FAT4表達對老年胃癌患者淋巴結轉移預測價值的ROC曲線

表2 血清整合素β6及組織中Prox-1、FAT4表達對老年胃癌患者淋巴結轉移的預測價值

3 討 論

胃癌是一種侵襲性和死亡率較高的惡性腫瘤,老年胃癌患者受組織器官衰退所致的治療耐受性減退、并發(fā)癥增加等不良因素影響,在治療方案的選擇方面更應慎重〔6〕。準確評估老年胃癌患者病情和預后水平,對治療方案的合理選擇具有重要的意義。血清腫瘤標志物是評價胃癌患者病情嚴重程度和預后水平的一種簡便、經濟、有效的方法,但仍未發(fā)現一種診斷效能理想的特定腫瘤標志物。整合素是一類異二聚體受體家族分子,能夠調控細胞間及細胞與胞外基質間黏附〔7〕。整合素β6最先在胚胎發(fā)育過程中被發(fā)現,其表達于上皮細胞〔8〕。作為一種上皮特異性表達的整合素亞型,整合素β6參與纖維化、細胞癌變等過程〔9〕。研究報道顯示,整合素β6參與了胰腺癌、頭頸部磷酸細胞癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生與轉移過程〔10,11〕,但在胃癌中作用特點的研究仍十分少見。本研究提示,老年胃癌患者血清整合素β6濃度明顯升高,且與TNM分期、腫瘤直徑、分化程度、淋巴結轉移密切相關。

Prox-1蛋白是果蠅轉錄因子在脊椎動物中的同源物,是一種核轉錄因子,在神經發(fā)育、肝臟發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用〔12〕。在淋巴結轉移陽性的乳腺癌患者中Prox-1高表達,提示Prox-1可能促進腫瘤細胞的淋巴結轉移過程〔13〕。FAT4屬于鈣黏蛋白超家族,FAT鈣黏蛋白具有相似的細胞外域結構,但細胞內域結構的差異性可能反映不同亞型的特異性功能〔14〕。目前關于FAT的研究主要集中在FAT1,能夠參與調節(jié)細胞間黏附和極性,參與細胞遷移過程,FAT1表達下調與腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關〔15〕。針對FAT4的研究較為少見,已有研究中使用RNA干擾技術下調腫瘤細胞中FAT4表達,腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯增強,提示FAT4具有抑癌作用〔16〕。本研究提示,老年胃癌患者中Prox-1高表達,FAT4低表達,且與病理特征密切相關。淋巴結轉移是胃癌患者不良預后的主要原因之一,淋巴結清掃范圍是胃癌外科治療中比較有爭議的問題。準確預測老年胃癌患者淋巴結轉移風險對治療方案的選擇至關重要。