張 馨 崔 娜 侯俊玲,3 王文全

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京,100102; 2 廊坊愛德堡醫(yī)院,廊坊,065000; 3 中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心,北京,100102; 4 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院/藥用植物研究所,北京,100193)

高尿酸血癥是由于嘌呤代謝異常,產(chǎn)物產(chǎn)生過多和(或)排泄障礙所導(dǎo)致的一種代謝性疾病[1]。高尿酸血癥一詞在中醫(yī)文獻(xiàn)中沒有明確記載,有學(xué)者認(rèn)為其屬“濕毒”范疇[2],從臨床看,歸屬中醫(yī)學(xué)“歷節(jié)”“痛風(fēng)”等范疇。

近年來,隨著我國經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展,我國居民的生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)已發(fā)生重大改變,高糖、高脂和高嘌呤食物攝入量顯著上升。我國高尿酸血癥患病率呈逐年上升、發(fā)病年齡低齡化等趨勢。高尿酸血癥已成為繼高血脂、高血糖、高血壓之后的第4大健康風(fēng)險(xiǎn)因素,即常說的“第四高”[3]。

研究表明,高尿酸血癥不僅會引起痛風(fēng),也與心血管疾病、糖尿病、高血壓和慢性腎臟病關(guān)系密切[4-11]。由此可見,高尿酸血癥已是當(dāng)前影響人類健康的一種嚴(yán)重疾病。近年來,中西醫(yī)在治療高尿酸血癥已獲得一定的成果和進(jìn)展,尤其中醫(yī)憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢,成為治療高尿酸血癥的熱點(diǎn)。因此建立穩(wěn)定的高尿酸血癥動物模型,對預(yù)防高尿酸血癥、篩選相關(guān)中西醫(yī)治療藥物尤為重要。

目前主要通過增加嘌呤攝入、抑制尿酸排泄和基因改造等方式進(jìn)行造模[12-14]。由于至今仍沒有國內(nèi)外統(tǒng)一規(guī)定和承認(rèn)的造模方式,所以造模方式多種多樣,評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)也各不相同。我們通過研究4種制造急性、慢性高尿酸血癥動物模型[15-16],進(jìn)行多次眼眶取血,動態(tài)觀察大鼠血清中的尿酸、肌酐、尿素氮等生化指標(biāo),評價(jià)各種模型的優(yōu)缺點(diǎn),以期為高尿酸血癥模型的合理建立和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 8周齡雄性無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠72只,體質(zhì)量180～220 g,購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動物許可證證號:SYXK(京)2017-0020,動物實(shí)驗(yàn)倫理許可號:SLXD(京)-20210604021。大鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心,飼養(yǎng)溫度為(24±2)℃,相對濕度(60±10)%,采用12 h/14 h晝夜交替照明,動物自由進(jìn)食和飲水。

1.1.2 藥物 氧嗪酸鉀(Oteracil Potassium,OAPS)(上海麥克林生化科技有限公司,批號:C12677304);酵母膏(Yeast Extract,YE)(上海麥克林生化科技有限公司,批號:C12434523);腺嘌呤(Adenine Phosphate,AP)(上海麥克林生化科技有限公司,批號:C12642922);次黃嘌呤(Hypoxanthine,HX)(上海麥克林生化科技有限公司,批號:H811076);鹽酸乙胺丁醇片(Ethambutol,EMB)(杭州民生藥業(yè)有限公司,批號:T21C068)。

1.1.3 試劑與儀器 羧甲基纖維素鈉(Carboxymethyl Cellulose Sodium,CMC-Na)(上海麥克林生化科技有限公司,批號:C12286568);無水乙醇(北京化工廠,批號:201909412);10%中性甲醛溶液(北京索萊寶科技有限公司,20210817);生理鹽水(山東華魯制藥有限公司,批號:H19010913);二甲苯(北京化工廠,批號:20190113);中性樹膠(上海儀器廠,批號:201901208);蘇木精染液(珠海貝索生物技術(shù)公司,批號:718072);伊紅染液(珠海貝索生物技術(shù)公司,批號:718091);血尿酸、血肌酐和尿素氮測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:C012-2-1;C011-2-1;C013-2-1)。全波長掃描酶標(biāo)儀[賽默飛世爾(上海)儀器有限公司,型號:Multiskan Mk3];恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器儀表公司,型號:HW·SY11-K);分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,型號:AL204];倒置顯微鏡(奧林巴斯,日本,型號:IX73P1F);冷凍離心機(jī)(Eppendorf,德國,型號:Centrifuge 5430R)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1)急性高尿酸血癥大鼠模型:36只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,按體質(zhì)量分為對照組、OAPS組和HX+OAPS組,每組12只。OAPS組給予腹腔注射300 mg/kg OAPS,同時(shí)給予皮下注射生理鹽水。HX+OAPS組給予腹腔注射300 mg/kg OAPS,同時(shí)給予皮下注射500 mg/kg HX。對照組同法給予腹腔和皮下注射生理鹽水。大鼠腹腔注射劑量10 mL/kg,皮下注射劑量2.5 mL/kg。2)慢性高尿酸血癥大鼠模型:36只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,按體質(zhì)量分為對照組、YE+AP+OAPS組和EMB+OAPS組,每組12只,對照組每天給予灌胃5% CMC-Na溶液;YE+AP+OAPS組每天給予灌胃15 g/kg YE的5% CMC-Na溶液,2 h后灌胃100 mg/kg AP的5% CMC-Na溶液,同時(shí)在第1、3、7、11、14天給予腹腔注射300 mg/kg OAPS生理鹽水溶液。EMB+OAPS組每天給予灌胃750 mg/kg OAPS和250 mg/kg EMB的5% CMC-Na混合溶液。以上各組普通飼料飼喂,正常飲水,連續(xù)飼喂2周,灌胃計(jì)量15 mL/kg,腹腔注射計(jì)量10 mL/kg。

1.2.2 檢測指標(biāo)與方法 1)急性高尿酸血癥大鼠模型:分別在0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、10 h目內(nèi)眥采血0.5 mL,將血樣4 ℃靜置30 min,離心15 min(3 500 r/min,有效離心半徑10 cm)取血清,-80 ℃冰箱放置。檢測血尿酸、血肌酐、血清尿素氮活性。2)慢性高尿酸血癥大鼠模型:在第14天,每組取6只大鼠腎臟進(jìn)行蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色切片;在第28天,取剩余大鼠腎臟進(jìn)行HE染色切片。在第4、6、8、11、14、15、16、18、20、22、25、28天大鼠目內(nèi)眥采集血液1.5 mL,血樣4 ℃靜置30 min,離心15 min(3 500 r/min,有效離心半徑10 cm)取血清,-80 ℃冰箱放置,檢測血尿酸、血肌酐、血清尿素氮水平。

2 結(jié)果

2.1 急性高尿酸血癥大鼠模型

2.1.1 各組血尿酸比較 與對照組比較,OAPS組和HX+OAPS組血尿酸在造模1 h左右均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在1～4 h間2組模型尿酸值均處于高水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。4～8 h尿酸值明顯下降,OAPS組在8 h左右,尿酸已經(jīng)恢復(fù)正常水平,HX+OAPS組在10 h與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組急性高尿酸血癥大鼠血尿酸比較

2.1.2 各組血肌酐比較 與對照組比較,OAPS組在造模1～2 h之間血肌酐顯著升高(P<0.01),4 h后恢復(fù)正常水平。HX+OAPS組在4～10 h顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組急性高尿酸血癥大鼠血肌酐比較

2.1.3 各組尿素氮比較 與對照組比較,OAPS組在造模2 h尿素氮出現(xiàn)短暫升高情況,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),之后恢復(fù)正常。HX+OAPS在1～10 h尿素氮均顯著高于正常水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表3 各組急性高尿酸血癥大鼠尿素氮比較

2.2 慢性高尿酸血癥大鼠模型

2.2.1 各組血尿酸比較 與對照組比較,YE+AP+OAPS組血尿酸在4～20 d明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),EMB+OAPS組在4～22 d明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

表4 各組慢性高尿酸血癥大鼠血尿酸比較

2.2.2 各組血肌酐 與對照組比較,YE+AP+OAPS組血肌酐在4～6 d升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而EMB+OAPS組在14～16 d升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且在20 d和25 d也有短暫性升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表5。

表5 各組慢性高尿酸血癥大鼠血肌酐比較

2.2.3 各組尿素氮比較 與對照組比較,YE+AP+OAPS組尿素氮在4～16 d顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),EMB+OAPS組在11～28 d顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 各組慢性高尿酸血癥大鼠尿素氮比較

2.2.4 各組慢性高尿酸血癥大鼠組織病理學(xué)結(jié)果 在14 d切片中,與對照組比較,YE+AP+OAPS、EMB+OAPS組的腎臟損傷嚴(yán)重。損傷主要在腎小管,腎小管擴(kuò)張嚴(yán)重,腎小管大面積管形,腎小管體積粗大,上皮變薄,空腔面積數(shù)倍增大并且空腔,在腎小管周圍存在炎癥細(xì)胞浸潤,腎組織纖維化。28 d切片中可以看出,YE+AP+OAPS組腎臟損傷有所恢復(fù),表現(xiàn)在炎癥細(xì)胞和空腔結(jié)構(gòu)的減少上,而EMB+OAPS組腎臟損傷并未有明顯改變。見圖1。

圖1 大鼠腎臟組織病理結(jié)果(HE染色,×100)

3 討論

尿酸是人嘌呤代謝的最終產(chǎn)物,主要通過肝臟、腎臟和腸道循環(huán)排出體外。高尿酸血癥多發(fā)生在靈長類動物中,是因?yàn)榫幋a尿酸氧化酶的基因失活,無法將尿酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成尿囊素從而導(dǎo)致尿酸在人體內(nèi)的增加。高尿酸血癥的發(fā)生主要有2種途徑,生成過多和排泄障礙。基礎(chǔ)研究證實(shí),90%的高尿酸血癥均由尿酸排泄減少所致,排泄障礙主要是指腎小管對尿酸的重吸收出現(xiàn)障礙,導(dǎo)致血尿酸水平異常升高,臨床上表現(xiàn)為肌酐和尿素氮的升高。中醫(yī)認(rèn)為高尿酸血癥病位在于脾腎,其病因?yàn)槠咔閮?nèi)傷、外感六淫、飲食不節(jié)等[16],亦提示“腎”與高尿酸血癥有密切關(guān)系。因此認(rèn)為,腎損傷可能是高尿酸血癥發(fā)生的重要原因。

隨著高尿酸血癥日益受到重視,找到一個(gè)穩(wěn)定性好、重復(fù)性好的高尿酸血癥動物模型成為各項(xiàng)研究的重點(diǎn),然而目前高尿酸血癥動物模型的誘導(dǎo)方法仍然存在周期長、穩(wěn)定性差等問題。急性高尿酸血癥發(fā)作是當(dāng)人體在一次性攝入過多高嘌呤物質(zhì),而體內(nèi)未能及時(shí)將其代謝,會出現(xiàn)血尿酸的急性升高及輕微的腎損傷[17-18]。所以造模時(shí)也是采用讓動物體內(nèi)尿酸一次性劇烈升高的方式。但是急性模型方法為單次造模,可觀察預(yù)防性給藥的療效,無法觀察治療性用藥的療效。目前常用的方法是一次性腹腔注射OAPS[19],方式單一,而且存在重復(fù)性不好的問題。本研究針對大鼠,通過將HX與OAPS聯(lián)合造模,與單一采用OAPS造模進(jìn)行對比,以期篩選出有效穩(wěn)定的急性模型。結(jié)果顯示,2種方法在造模后都顯著提高了尿酸水平,但是OAPS組高尿酸水平維持時(shí)間較短,而HX+OAPS組10 h時(shí)仍然維持在高水平。OAPS組出現(xiàn)了血肌酐和尿素氮短暫性升高,而HX+OAPS組同樣顯示出了更長時(shí)間的高水平。以上可以看出HX+OAPS組相比OAPS組高尿酸血癥癥狀維持時(shí)間長,作為急性預(yù)防模型有著更加明顯和穩(wěn)定的高尿酸水平升高和腎臟損傷,更加適用于中西醫(yī)預(yù)防性藥物的篩選。

對于慢性高尿酸血癥模型造模機(jī)制，主要在于尿酸的長期積累從而導(dǎo)致其他疾病發(fā)生，尤其是腎臟疾病[20-22]。綜合之前學(xué)者的研究，選取了YE+AP+OAPS和EMB+OAPS這2種方式，造模給藥14 d后繼續(xù)觀察14 d，觀察模型維持情況[23-24]。結(jié)果顯示，2種模型均顯著提高了尿酸水平，停止給造模劑后可以維持1周左右時(shí)間，EMB+OAPS組維持時(shí)間更長。血肌酐和尿素氮結(jié)合病理切片結(jié)果顯示2種造模方式均出現(xiàn)腎臟損傷，YE+AP+OAPS組在停止造模后腎損傷情況有所改善，而EMB+OAPS組腎臟損傷更加嚴(yán)重，在停止給造模藥物2周后各項(xiàng)指標(biāo)仍處于高水平。綜上所述，2種14 d的造模方式都可以顯著提高尿酸水平并伴有明顯的腎臟損傷，而且在停止造模后1周仍維持原來的高尿酸血癥病理狀態(tài)。說明14 d的造模方法可取，可以縮短造模時(shí)間但是沒有影響造模效果，一定程度上可以節(jié)約時(shí)間和成本費(fèi)用。EMB+OAPS組比YE+AP+OAPS組高尿酸血癥病理狀態(tài)更明顯維持的時(shí)間更長在治療高尿酸血癥藥物篩選上EMB+OAPS造模方法更優(yōu)于YE+AP+OAPS造模方法。

綜上所述,實(shí)驗(yàn)中的造模方法操作簡單且實(shí)用性強(qiáng),為中西醫(yī)治療高尿酸血癥藥物的開發(fā)提供了評價(jià)工具及基礎(chǔ)的造模數(shù)據(jù)。

利益沖突聲明:無。