黎發(fā)根 王 亮 李紹旦 楊明會 周建平 劉 毅

(1 解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心中醫(yī)醫(yī)學(xué)部,北京,100853; 2 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所,北京,100850)

失眠癥是以頻繁而持續(xù)地入睡困難和(或)睡眠維持困難并導(dǎo)致睡眠感不滿意為特征的睡眠障礙[1],是臨床上常見的一種睡眠障礙性疾病,發(fā)生率高,長期的失眠會嚴(yán)重影響人們的身心健康[2-4]。目前西醫(yī)對失眠的治療以鎮(zhèn)靜催眠藥物為主,而長期應(yīng)用這類藥物不良反應(yīng)較多,且治療效果不理想[5-6]。在既往研究中應(yīng)用和胃安神法中藥治療失眠癥取得良好臨床療效[7],但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究應(yīng)用失眠大鼠模型,通過觀察下丘腦中5-羥色胺(5-hydroxytryptamin,5-HT)、多巴胺(Dopamine,DA)、去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)水平的變化,進(jìn)一步探討和胃安神方治療失眠癥的可能療效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級Wistar健康雄性大鼠50只,體質(zhì)量(200±20)g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供,動物合格證號:SCXK京2019-0003。提前1周將大鼠飼養(yǎng)在12 h光照(7:00～19:00)、12 h黑暗(19:00～7:00)的安靜環(huán)境下,自由飲水?dāng)z食,室溫保持(24±2)℃,相對濕度40%～50%。所有實(shí)驗(yàn)流程均經(jīng)解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審批號:SCXK-2019-057)。

1.1.2 藥物 和胃安神方由半夏10 g、薏苡仁15 g、陳皮15 g、茯苓15 g、石菖蒲10 g、合歡皮10 g、炒棗仁15 g、夜交藤15 g組成,所有飲片均經(jīng)解放軍總醫(yī)院中藥房提供并鑒定。將上述諸藥按傳統(tǒng)煎藥法文火煎30 min,以恒溫水浴鍋濃縮成含生藥1.05 g/mL的藥液,由玻璃瓶密閉盛裝,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。地西泮?天津力生制藥股份有限公司,批號:H12020119)。

1.1.3 試劑與儀器 對氯苯丙氨酸(4-Chloro-DLphenylalanine,PCPA)(Sigma公司,美國,批號:C6506);5-HT、DA、NE的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked Immunoadsordent Assay,ELISA)檢測試劑盒(北京新亞太生物科技有限公司,貨號分別為:10004310,10009127,30001020)。MORRIS水迷宮視頻分析系統(tǒng)(上海軟隆科技發(fā)展有限公司,型號:BW-BW-MWM101);高速冷凍離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司,型號:LGR20-W)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 通過隨機(jī)數(shù)字表將60只大鼠分為6組,即正常對照組、失眠模型組、地西泮組、和胃安神方低劑量組、和胃安神方中劑量組、和胃安神方高劑量組,每組10只。采用對氯苯丙氨酸(Para-Chloro-DL-phenylalanine,PCPA)誘導(dǎo)失眠模型。除正常對照組外,其余組大鼠參照文獻(xiàn)[8]并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,按300 mg/kg體質(zhì)量以10 mL/kg于每天上午8:00～8:30進(jìn)行PCPA腹腔注射,1次/d,連續(xù)2 d。于第1次腹腔注射28～30 h后,大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失,白天活動不停,整體觀察與正常對照組有明顯不同,表明模型復(fù)制成功[9]。

1.2.2 給藥方法 于第3天開始每天上午8:00進(jìn)行灌胃給藥,按大鼠每公斤體質(zhì)量用藥量為成人(60 kg)每公斤體質(zhì)量用藥量的6倍換算,作為和胃安神方中劑量組(10.5 g/kg),和胃安神方高劑量組和和胃安神方低劑量組分別為中劑量的2倍(21 g/kg)和0.5倍(5.25 g/kg),和胃安神方各劑量組每天給予對應(yīng)中藥水煎液10 mL/kg。地西泮組給予相同體積92 mg/L地西泮水溶液,地西泮片按成人催眠劑量10 mg/d,用人與大鼠給藥劑量體表面積折算計(jì)算出大鼠給藥劑量為0.92 mg/(kg·d)。正常對照組、失眠模型組給予相同體積的生理鹽水,1次/d,連續(xù)灌胃6 d。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 行為學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)期間每日觀察并記錄各組大鼠毛發(fā)、飲食、活動及睡眠情況。

1.2.3.2 學(xué)習(xí)記憶能力測定 應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)記憶力測定[10]。Morris水迷宮直徑120 cm,高50 cm,水池內(nèi)壁為白色,將圓桶分為1、2、3、4共4個象限,分別設(shè)置4個入水點(diǎn),將直徑10 cm,高20 cm的白色圓柱形平臺隨機(jī)置于某一象限正中。實(shí)驗(yàn)時,水面高出平臺約1.5 cm,水中加入二氧化鈦,使其呈乳白色不透明狀,水溫控制在(20±2)℃。測試過程中水迷宮周圍的參照物均保持不變,實(shí)驗(yàn)者的位置也保持相對固定,并保持環(huán)境安靜,光線適度。造模前先對各組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練3 d,并記錄訓(xùn)練成績。實(shí)驗(yàn)后立即將大鼠置于水迷宮觀察各組大鼠的定位航行能力及空間搜索能力。主要觀察指標(biāo):潛伏期,即大鼠從入水到找到平臺的時間。

1.2.3.3 下丘腦5-HT、DA、NE檢測 于末次給藥24 h后,將大鼠脫頸處死,迅速斷頭取腦,分離下丘腦,充分勻漿后低溫離心,離心機(jī)在4 ℃以8 000 r/min,離心10 min,離心半徑8.2 cm,取上清液,于-20 ℃保存待測。采用ELISA法檢測大鼠5-HT、DA、NE的水平,按試劑盒說明操作。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)變化 失眠模型組、地西泮組及和胃安神方各劑量組連續(xù)2 d腹腔注射PCPA后,大鼠毛發(fā)雜亂,無光澤,晝夜節(jié)律消失,白天活動不停,容易激惹,進(jìn)食、飲水增多,睡眠減少直至消失,與正常對照組有明顯差異。隨著灌胃天數(shù)增加,和胃安神方各劑量組及地西泮組大鼠的上述表現(xiàn)均有不同程度的改善,其中和胃安神方高劑量組、和胃安神方中劑量組改善明顯,治療至第6天時,晝夜節(jié)律已基本恢復(fù)。

2.2 學(xué)習(xí)記憶力測定 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前Morris水迷宮訓(xùn)練的平均潛伏期差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),實(shí)驗(yàn)后各組大鼠測試潛伏期均較實(shí)驗(yàn)前縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與失眠模型組比較,和胃安神方低劑量組和地西泮組測試潛伏期與失眠模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);和胃安神方中劑量組、高劑量組測試潛伏期均較失眠模型組顯著縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)前后大鼠水迷宮測試潛伏期比較

2.3 各組大鼠下丘腦5-HT、DA、NE水平比較 失眠模型組大鼠5-HT水平較正常對照組顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),DA、NE水平較正常對照組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);和胃安神方低劑量組和地西泮組5-HT、DA、NE水平與失眠模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);和胃安神方中劑量組、和胃安神方高劑量組5-HT水平均較失眠模型組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),DA、NE水平較失眠模型組均顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠下丘腦5-HT、DA、NE水平比較

3 討論

隨著生活和工作的節(jié)奏加快,人們的社會壓力明顯增加,失眠發(fā)生率呈逐年上升的趨勢[11-12]。多年的理論研究及臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn),原發(fā)性失眠與“胃”密切相關(guān),失眠的基礎(chǔ)在于“胃”[13]。早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有“胃不和則臥不安”的記載,且中醫(yī)理論關(guān)于失眠的學(xué)說如“陰陽說”“神主說”“營衛(wèi)說”“氣血說”等都與“胃”密切相關(guān)[14]。一則因?yàn)槲改巳梭w陰陽升降之樞紐,二則因?yàn)椤拔浮蹦恕八葰庋！?是“后天之本、營衛(wèi)之源”,而“神者,水谷之精氣也”。胃氣調(diào)和、升降有序,則氣血化生有源,營衛(wèi)循其常度,陰陽自和,而神安夜眠,故“胃和”則“寐安”。而現(xiàn)代生活方式和飲食結(jié)構(gòu)習(xí)慣的變化,常常引起人體脾胃、腸道的消化功能紊亂,即“胃不和”。因此針對原發(fā)性失眠者的“胃不和”采用和胃安神方以治之。既往的臨床研究證實(shí)其對失眠癥的治療效果良好[7,15],但其療效機(jī)制尚不明確。

和胃安神方由半夏、薏苡仁、炒棗仁、石菖蒲、茯苓、夜交藤、合歡皮、陳皮組成。其中半夏燥濕化痰、降逆止嘔,可“除腹脹,目不得眠”,薏苡仁健脾益胃、滲濕利水,二者合用,取半夏秫米湯和胃安神之意。炒棗仁寧心安神,石菖蒲開竅寧神,茯苓健脾寧心,夜交藤養(yǎng)心安神,合歡皮解郁寧心,佐以陳皮健脾化痰、調(diào)中和胃,諸藥合用,共奏和胃安神之功。

5-HT是睡眠調(diào)節(jié)最為重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一[16],其對慢波睡眠的發(fā)生及維持起著重要的作用,是能夠促進(jìn)睡眠的神經(jīng)遞質(zhì)[17]。有研究者在鼠和貓身上分別給予PCPA后慢波睡眠顯著減少,而給予小劑量的5-HT后睡眠則修復(fù)[18]。DA是腦內(nèi)含量最多的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一,具有維持覺醒和行為興奮的作用[19]。NE也是一種公認(rèn)的參與覺醒的單胺類神經(jīng)遞質(zhì),其釋放量增加可引起交感神經(jīng)系統(tǒng)活性增強(qiáng),導(dǎo)致睡眠-覺醒紊亂,釋放量的減少則可促進(jìn)睡眠[20-21]。

本研究采用國際公認(rèn)的PCPA腹腔注射誘導(dǎo)的失眠大鼠模型,其結(jié)果顯示,失眠模型組大鼠下丘腦5-HT水平顯著下降,DA、NE水平顯著升高,和胃安神方中劑量組、和胃安神方高劑量組治療后5-HT水平明顯高于模型組,DA、NE水平明顯低于模型組,且大鼠睡眠節(jié)律得以恢復(fù),學(xué)習(xí)記憶力得以改善。本研究結(jié)果提示,對5-HT、DA、NE等神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)作用可能是和胃安神方治療失眠的內(nèi)在機(jī)制之一。對于和胃安神方調(diào)節(jié)此類神經(jīng)遞質(zhì)的具體途徑和作用機(jī)制,還有待深入研究。

利益沖突聲明:無。