韓亞光 宋思鈺 孫小惠 韓延華 朱小琳

(1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,哈爾濱,150040; 2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱,150040;3 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,哈爾濱,150001)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis,EMs)指正常脫落的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞種植在腹壁、卵巢等位置,常見于育齡期婦女,主要臨床表現(xiàn)為下腹痛、不孕、性交痛。該病發(fā)病率逐年上升,達(dá)10%～20%[1],不孕婦女中發(fā)病率更高,嚴(yán)重影響患者身心健康。目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚,雌激素依賴性疾病、炎癥性疾病是對(duì)EMs的統(tǒng)一認(rèn)識(shí)[2]。西醫(yī)治療EMs主要是以激素和手術(shù)為主,但不良反應(yīng)大或有創(chuàng)傷性損傷[3]。近年來中醫(yī)療法在治療EMs等慢性疾病中被廣泛認(rèn)可,針刺治療靈活、不良反應(yīng)少,深受EMs患者青睞,越來越多的研究表明針刺能夠緩解EMs疼痛、抑制異位組織血管生成和侵襲黏附、調(diào)節(jié)免疫功能及內(nèi)分泌,改善相關(guān)癥狀[4-8]。本課題組探究其療效及作用機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取6周齡未孕健康Sprague-Dawley(SD)清潔級(jí)雌性大鼠47只,體質(zhì)量190～210 g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(黑)20180004。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)婦科實(shí)驗(yàn)室,日常保持飼舍溫度(23±2)℃,濕度(55±5)%,自然采光,對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用自由飲水和采食。所有實(shí)驗(yàn)均遵守黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理研究委員會(huì)發(fā)布的倫理指南(倫理審批號(hào):GLWJ-ZD-019)。

1.1.2 器具 毫針:貴州安迪牌針灸針,規(guī)格為0.25 mm×40 mm,貴州安迪藥械有限公司產(chǎn)。改良后使用。

1.1.3 試劑與儀器 原位末端凋亡法(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL)細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(上海翌圣生物科技有限公司,貨號(hào):40308ES20);兔抗鼠磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide3-kinase,PI3K)試劑盒(CST公司,美國(guó),貨號(hào):4249);蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)(CST公司,美國(guó),貨號(hào):4691);哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin,mTOR)試劑盒(CST公司,美國(guó),貨號(hào):2983);兔抗胱天白酶-3(Caspase-3)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):201901029);Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X Protein,Bax)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):20190118);B細(xì)胞淋巴瘤2(B Cell Lymphoma 2,Bcl-2)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):20190302);核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司,貨號(hào):DP430];反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme公司,貨號(hào):R211-01);熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)試劑盒(Qiagen公司,美國(guó),貨號(hào):208054)。冰凍切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司,德國(guó),型號(hào):RM2135);光學(xué)顯微鏡(NIKON公司,日本,型號(hào):Eclipse ci);多功能酶標(biāo)儀(Tecan公司,瑞士,型號(hào)Infinite F50);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司,美國(guó),型號(hào):7500);熒光倒置顯微鏡(德國(guó)蔡司公司,德國(guó),型號(hào):Axio型);電泳儀(Bio-rad公司,美國(guó),型號(hào):042BR13724)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將47只SD大鼠分為2組，對(duì)照組12只，35只造模。造模過程中死亡9只，最后造模成功24只。將造模成功的24只大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和針刺組，每組12只。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,采用自體子宮內(nèi)膜組織移植于腸系膜的建模方法[9-11],建立EMs大鼠模型。術(shù)前24 h皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.1 mL/kg,使所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在造模前統(tǒng)一處于動(dòng)情期[12]。腹腔1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)注射麻醉,麻醉成功后,開腹找到子宮,在右側(cè)子宮剪下長(zhǎng)約1 cm的子宮組織,行遠(yuǎn)端結(jié)扎包埋術(shù),剝離剪下的子宮組織,切成3 mm×3 mm小組織片,選擇0～4號(hào)腸線將組織片縫到靠近腹部?jī)?nèi)膜層的腸系膜上,使子宮組織的內(nèi)膜層面向腸系膜,檢查是否存在腸管損傷或者出血現(xiàn)象,確定均無此現(xiàn)象后,用可吸收的2-0線將切開逐層縫合,腹腔注射青霉素8 IU∶0.25 mL,用碘伏消毒縫合處。在術(shù)后的前3 d,每天給大鼠肌內(nèi)注射青霉素。常規(guī)飼養(yǎng)4周,觀察大鼠進(jìn)食、活動(dòng)狀態(tài)、大小便情況。對(duì)照組前期準(zhǔn)備工作同造模大鼠,切除子宮組織后僅用可吸收的4-0線在腸系膜縫合,并未將子宮組織片縫合到腸系膜上,余處理同造模大鼠。手術(shù)在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)婦科實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房?jī)?nèi),嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)范進(jìn)行。

造模4周后行開腹觀察異位囊腫變化情況作為造模是否成功的初步判斷,再進(jìn)行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin,HE)染色,若見內(nèi)膜上皮細(xì)胞、腺體和間質(zhì)細(xì)胞即為造模成功。將造模成功的大鼠,再次逐層縫合,均肌內(nèi)注射青霉素8 IU∶0.25 mL,連續(xù)3 d。

1.2.2 干預(yù)方法 采取以下治療方案:對(duì)照組及模型組,無特殊干預(yù),正常清潔飼養(yǎng)。模型組:造模成功后,正常清潔飼養(yǎng),無特殊干預(yù)。針刺組:每日9時(shí),在清醒狀態(tài)下,將大鼠固定在手術(shù)固定臺(tái),用32#針,選取大鼠腹部關(guān)元穴(臍下25 mm)、中極穴(臍下34 mm)和雙側(cè)子宮穴(卵巢解剖部位)以5～8 mm深度進(jìn)針,另取雙側(cè)三陰交穴(后肢內(nèi)踝尖直上10 mm)以4～5 mm深度進(jìn)針,且刺入即刻和留針10 min時(shí)分別施提插捻轉(zhuǎn)手法30 s,留針30 min/次,1次/d,連續(xù)28 d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

治療第28天,對(duì)3組大鼠禁食12 h后,稱重,在大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg),麻醉成功后對(duì)大鼠心臟采血。將采血管充分搖勻后,放于低溫離心機(jī),在4 ℃,離心半徑8 cm,4 000 r/min離心15 min,將上層血清用移液器分裝到0.5 mL的EP管中,存放于-20 ℃冰箱中待用。

無菌手術(shù)條件下,開腹取在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織,截取長(zhǎng)度1 cm。將取出的造模區(qū)域和子宮組織浸泡到滅菌的生理鹽水,將組織表面血液、脂肪、血管等清洗剝離干凈。用小手術(shù)剪,將組織樣品剪成5 mm×5 mm小組織塊,取1/4浸泡于10%甲醛溶液中,1/4浸泡于OCT(Opti-mum Cutting Temperature Compound)包埋劑中,剩余的組織塊保存于凍存管中,用液氮速凍后,保存于-80 ℃的超低溫冰箱中待用。

1.2.3.1 HE染色觀察在位、異位內(nèi)膜組織病理形態(tài) 取浸泡于10%甲醛溶液的子宮內(nèi)膜組織,經(jīng)梯度乙醇脫水,二甲苯透明、石蠟液包埋、切片、蘇木精染色、伊紅染色、梯度乙醇脫水、中性樹膠封片,倒置光學(xué)顯微鏡下觀察子宮組織形態(tài)并拍照。

1.2.3.2 TUNEL檢測(cè)在位、異位內(nèi)膜組織細(xì)胞凋亡 浸泡于OCT包埋劑的樣品放置于預(yù)冷樣品盤。切片機(jī)作5 μm切片,采用丙酮浸泡、烘干、磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)清洗、蛋白酶K溶液浸泡、PBS清洗、過氧化氫(Hydrogen Peroxide,H2O2)溶液浸泡、PBS清洗、脫氧核糖核酸酶I(DNase I)溶液浸泡、PBS沖洗后。再將滴加50 μL的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxyribonucleotidyl Transferase,TdTase)反應(yīng)液,暗盒37 ℃避光反應(yīng)60 min(加蓋蓋玻片),PBS反復(fù)清洗。加入50 μL的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)反應(yīng)液,暗盒中37 ℃條件避光反應(yīng)15 min(加蓋蓋玻片),用PBS反復(fù)清洗。熒光顯微鏡對(duì)切片拍照和分析。

1.2.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)在位、異位內(nèi)膜組織雌激素受體α(Estrogen Receptor α,ER-α)、雌激素受體β(Estrogen Receptor β,ER-β)、PI3K、AKT、mTOR、Caspase-3、Bax、Bcl-2基因表達(dá) 取樣品,采用研磨法提取信使RNA(Messenger RNA,mRNA),測(cè)定總RNA濃度,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸(Complementary DNA,cDNA),按PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增,在PCR儀上進(jìn)行檢驗(yàn),結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參,2-△△Ct法分析相對(duì)mRNA表達(dá)量。見表1。

表1 各基因引物系列

1.2.3.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)在位、異位內(nèi)膜組織ER-α、ER-β、PI3K、AKT、mTOR、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白含量 大鼠內(nèi)膜組織加裂解液冷凍勻漿后,以4 ℃,離心半徑8 cm,12 000 r/min離心10 min,上清液經(jīng)二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)法檢測(cè)蛋白濃度。上樣量為20 μL,電泳條件100 V,90 min,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,冰上轉(zhuǎn)膜,加入1抗,孵育過夜,清洗,加入2抗,孵育,清洗,進(jìn)行ECL顯影、曝光及掃描,采用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,對(duì)目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 針刺對(duì)大鼠在位、異位內(nèi)膜組織病理學(xué)的影響 病理切片結(jié)果發(fā)現(xiàn),異位內(nèi)膜組織中,對(duì)照組子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞排列緊密多為柱狀,腺體結(jié)構(gòu)清晰,腺體結(jié)構(gòu)完整;模型組可見細(xì)胞核排列紊亂,腺體結(jié)構(gòu)不完整,有明顯異位增生和炎癥介質(zhì)浸潤(rùn);針刺組異位內(nèi)膜組織形態(tài)分布規(guī)律趨于正常,異位增生和炎癥介質(zhì)浸潤(rùn)明顯緩解。見圖1。

圖1 3組大鼠在位與異位內(nèi)膜組織病理學(xué)變化(HE染色,×200)

2.2 針刺對(duì)大鼠在位、異位內(nèi)膜組織的細(xì)胞凋亡的影響 與模型組比較,針刺組在位細(xì)胞凋亡無明顯增加,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組和模型組異位組織細(xì)胞凋亡現(xiàn)象較少,而針刺組細(xì)胞凋亡顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 3組大鼠細(xì)胞凋亡變化(DAPI染色,×200)

2.3 針刺對(duì)大鼠在位、異位內(nèi)膜組織ER-α和ER-β基因表達(dá)的影響 3組大鼠在位內(nèi)膜組織中,ER-α和ER-β基因相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組大鼠異位內(nèi)膜組織中,模型組ER-α和ER-β基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和針刺組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);針刺組ER-α和ER-β基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于在位內(nèi)膜組織的針刺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),ER-β基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于異位內(nèi)膜組織的對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在基因表達(dá)方面,在位內(nèi)膜組織3組ER-β/ER-α差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);模型組異位內(nèi)膜組織ER-β/ER-α顯著高于(P<0.05)對(duì)照組和針刺組(P<0.05),也顯著高于在位內(nèi)膜組織模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而針刺組ER-β/ER-α雖然高于對(duì)照組,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組雌激素受體基因表達(dá)變化

2.4 針刺對(duì)大鼠在位、異位內(nèi)膜組織ER-α和ER-β蛋白含量的影響 3組大鼠的在位內(nèi)膜組織中,ER-α和ER-β蛋白含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。3組大鼠的異位內(nèi)膜組織中,模型組ER-α和ER-β蛋白含量顯著高于對(duì)照組和針刺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);針刺組ER-β和ER-β/ER-α蛋白含量顯著高于在位內(nèi)膜組織針刺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3組在位內(nèi)膜組織的ER-β/ER-α差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);模型組異位內(nèi)膜組織ER-β/ER-α顯著高于對(duì)照組和針刺組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),也顯著高于在位內(nèi)膜組織模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);針刺組的ER-β/ER-α顯著高于對(duì)照組和在位內(nèi)膜組織模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

表3 3組雌激素受體ER-α和ER-β蛋白含量變化

2.5 針刺對(duì)大鼠在位、異位內(nèi)膜組織PI3K/AKT/mTOR基因表達(dá)的影響 3組大鼠在位內(nèi)膜組織中,PI3K、AKT和mTOR基因表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。3組大鼠異位內(nèi)膜組織中,模型組PI3K、AKT和mTOR基因表達(dá)顯著高于對(duì)照組和針刺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);干預(yù)后,針刺組PI3K、AKT和mTOR基因表達(dá)低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜組織比較,異位內(nèi)膜對(duì)照組和模型組PI3K、AKT和mTOR基因表達(dá)與在位內(nèi)膜差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),異位內(nèi)膜針刺組顯著低于在位內(nèi)膜。見表4。

表4 3組PI3K/AKT/mTOR通路基因表達(dá)變化

2.6 針刺對(duì)大鼠在位、異位內(nèi)膜組織PI3K/AKT/mTOR通路蛋白含量的影響 3組大鼠在位內(nèi)膜組織中,PI3K、AKT和mTOR蛋白含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。在大鼠的異位內(nèi)膜組織中,模型組PI3K、AKT和mTOR蛋白含量顯著高于對(duì)照組和針刺組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),并且mTOR蛋白含量顯著高于在位模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);針刺組PI3K、AKT和mTOR蛋白含量顯著低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。異位對(duì)照組PI3K和AKT蛋白含量顯著低于在位對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),mTOR蛋白含量顯著高于在位對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);異位針刺組PI3K和AKT蛋白含量顯著低于在位對(duì)照組。3組大鼠在位內(nèi)膜組織和異位內(nèi)膜組織PI3K、AKT、mTOR蛋白含量的變化趨勢(shì)與PI3K、AKT、mTOR基因表達(dá)量相一致。見表5。

表5 3組PI3K/AKT/mTOR蛋白表達(dá)變化

2.7 針刺對(duì)大鼠在位、異位內(nèi)膜組織Caspase-3、Bax、Bcl-2基因表達(dá)的影響 3組大鼠在位內(nèi)膜組織中,Caspase-3、Bax和Bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)后,3組大鼠異位內(nèi)膜組織中,針刺組Caspase-3和Bax基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),Bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組和模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。對(duì)針刺組在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜Caspase-3、Bax和Bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量比較，發(fā)現(xiàn)異位內(nèi)膜針刺組的Caspase-3和Bax基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于在位內(nèi)膜針刺組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，異位內(nèi)膜針刺組Bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于在位內(nèi)膜針刺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 3組大鼠凋亡相關(guān)因子基因表達(dá)變化

2.8 針刺對(duì)大鼠在位、異位內(nèi)膜組織Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白含量的影響 3組大鼠在位內(nèi)膜組織Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組大鼠異位內(nèi)膜組織模型組Caspase-3和Bax蛋白含量有高于對(duì)照組趨勢(shì),Bcl-2蛋白含量有低于對(duì)照組趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05);干預(yù)后,針刺組Caspase-3和Bax蛋白含量顯著高于對(duì)照組和模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，Bcl-2蛋白含量顯著低于對(duì)照組和模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。異位內(nèi)膜針刺組Caspase-3和Bax蛋白含量顯著高于在位內(nèi)膜針刺組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，而異位內(nèi)膜針刺組Bcl-2蛋白含量顯著低于在位內(nèi)膜針刺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表7。

表7 3組大鼠凋亡相關(guān)因子蛋白含量變化

3 討論

EMs是指脫落的子宮內(nèi)膜細(xì)胞種植于子宮體腔以外的其他部位,具有較高發(fā)病率和復(fù)發(fā)率,是女性極為常見的良性慢性雌激素依賴性疾病[13-16];又因其具有浸潤(rùn)生長(zhǎng)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,可侵犯和損害周圍組織等惡性腫瘤的生物學(xué)行為,也被稱為是“不死亡的癌癥”。其發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前存在多種觀點(diǎn)和理論,都具有一定說服力?！敖?jīng)血逆流學(xué)說”認(rèn)為脫落的子宮內(nèi)膜組織隨經(jīng)血逆流入卵巢或盆腹腔其他組織,種植生長(zhǎng)[17-18]。而郎景和教授[19]的“在位內(nèi)膜決定論”指出個(gè)體在位內(nèi)膜的特性才是決定異位內(nèi)膜能否逆流并轉(zhuǎn)移、種植的關(guān)鍵,EMs的發(fā)生進(jìn)展可分為“黏附-侵襲-血管生成”3階段。本課題組前期研究通過基因芯片技術(shù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行篩查,發(fā)現(xiàn)在異位內(nèi)膜組織中存在異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡減弱現(xiàn)象[20],現(xiàn)為驗(yàn)證及探究其深層作用機(jī)制開展研究。

凋亡是一種死亡機(jī)制,細(xì)胞通過基因調(diào)控死亡,使細(xì)胞進(jìn)行更新迭代[21],此過程是維持細(xì)胞和組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵機(jī)制,因此促進(jìn)異位組織細(xì)胞凋亡對(duì)EMs的治療至關(guān)重要。影響凋亡的相關(guān)蛋白分2類,一類是抗凋亡蛋白,如Bcl-2;一類為促凋亡蛋白,如Caspase-3、Bax,這3種凋亡因子在EMs研究較多。而PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路、核因子κB信號(hào)通路是影響凋亡的上游通路。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與子宮內(nèi)膜的黏附、侵襲、血管形成以及細(xì)胞凋亡等過程,而PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路和雌激素調(diào)控在此過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)EMs患者體內(nèi)雌激素相關(guān)受體比正常對(duì)照組明顯升高,尤其是雌激素受體-β[24]。ER-β被認(rèn)為具有抗增殖和促凋亡作用,高水平的ER-β通過誘導(dǎo)環(huán)氧合酶2的合成從而刺激組織細(xì)胞中前列腺素產(chǎn)生并與相應(yīng)受體結(jié)合,激活A(yù)KT通路,使PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路調(diào)控作用異常,影響細(xì)胞的凋亡、遷移和自噬等,促進(jìn)EMs發(fā)生、發(fā)展[24]。而針刺治療可以下調(diào)在位及異位內(nèi)膜組織中ER-β表達(dá),使其趨于正常子宮內(nèi)膜水平,達(dá)到治療大鼠EMs的效應(yīng)[25];還能通過誘導(dǎo)基因釋放與轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞因子及細(xì)胞內(nèi)小分子釋放和傳遞等對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響[26-27]。因此基于PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路探究針刺療法治療EMs的作用機(jī)制理論上是可行的。

中醫(yī)學(xué)注重整體觀念與辨證論治的相統(tǒng)一,在治療EMs上尤其注重整體調(diào)整機(jī)體內(nèi)環(huán)境及微穩(wěn)態(tài),針刺作為中醫(yī)整體觀念的具體體現(xiàn),在辨證選穴的基礎(chǔ)上,直接作用于病變位置,充分發(fā)揮“直達(dá)病所”的優(yōu)勢(shì)。選取關(guān)元、中極、子宮、三陰交等穴以活血化瘀,散結(jié)止痛。EMs病位在胞宮,與沖任二脈關(guān)系密切,其中關(guān)元、中極、子宮穴同居小腹,關(guān)元為小腸經(jīng)募穴,統(tǒng)治足三陰、小腸、任脈諸經(jīng)病,具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、溫通經(jīng)絡(luò)、理氣和血、補(bǔ)虛益損等作用[28],古今均作為保健要穴;中極通于胞宮具有補(bǔ)氣行氣活血、調(diào)理沖任的作用;子宮屬經(jīng)脈奇穴,為婦科要穴之一,主治月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)等;三陰交為足三陰經(jīng)交會(huì)穴,主治生殖系統(tǒng)疾病,能夠具通調(diào)沖任,緩急止痛。研究發(fā)現(xiàn)針刺通過影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疼痛感覺機(jī)制,鎮(zhèn)靜止痛,從而達(dá)到治療EMs痛經(jīng)的目的,且針刺腹部腧穴能降低異位內(nèi)膜的活性,促進(jìn)異位內(nèi)膜萎縮[29]。目前研究多從針刺陣痛、抑制“黏附、侵襲、血管生成”和雌激素代謝等方向研究治療EMs,但作用機(jī)制尚不明確[30]。

本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠異位內(nèi)膜組織細(xì)胞核排列紊亂,腺體結(jié)構(gòu)不完整,有明顯異位增生和炎癥介質(zhì)浸潤(rùn),雌激素受體α、ER-β表達(dá)升高,符合EMs特征。而針刺治療后,模型組異位組織抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低,促凋亡蛋白Caspase-3、Bax表達(dá)明顯升高,大鼠異位增生和炎癥介質(zhì)浸潤(rùn)得到緩解,異位組織凋亡明顯增加,表明針刺治療能夠上調(diào)凋亡因子的表達(dá),促進(jìn)異位組織凋亡。針刺治療前后雌激素受體和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路基因表達(dá)和蛋白含量的變化,提示針刺的治療作用可能是通過調(diào)控了體內(nèi)ER-β水平,進(jìn)而影響了PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)病灶細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)研究針刺對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠細(xì)胞凋亡及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響,為針刺治療子宮內(nèi)膜異位癥機(jī)制研究提供了新思路。

利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突關(guān)系。