王宇婷 李金飛 徐文龍 劉薈菁 王嘉璽

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院,北京,100078; 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院通州院區(qū),北京,101100; 3 大興區(qū)婦幼保健院,北京,102600)

季節(jié)性變應(yīng)性鼻炎(Seasonal Allergic Rhinitis,SAR)是IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng),表現(xiàn)為季節(jié)性反復(fù)發(fā)作的鼻塞、噴嚏、流清涕等癥狀,為臨床常見病。SAR發(fā)病率與空氣中PM 2.5濃度正相關(guān)[1]。治療方面,中醫(yī)藥在延緩發(fā)作頻率和減少發(fā)作癥狀上有獨(dú)特的優(yōu)勢[2]。

蒼耳子散作為中醫(yī)治療SAR的傳統(tǒng)經(jīng)典名方,其作用機(jī)制值得深入挖掘與研究。中藥復(fù)方的作用機(jī)制具有多靶點(diǎn)、多層次、范圍廣的優(yōu)勢。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于多學(xué)科理論基礎(chǔ),除醫(yī)學(xué)、生物學(xué)外,包括計(jì)算機(jī)科學(xué)、生物信息學(xué)等,并整合多種研究手段而形成的研究方法[3]。應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對中藥復(fù)方作用機(jī)制進(jìn)行研究,有助于揭示中藥復(fù)方科學(xué)內(nèi)涵、發(fā)現(xiàn)作用靶點(diǎn)、為實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中藥復(fù)方治療的靶點(diǎn)提供方向。

1 資料與方法

1.1 蒼耳子散相關(guān)靶點(diǎn)基因篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)中,設(shè)置口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18,對化合物在動(dòng)物體內(nèi)的毒藥物動(dòng)力學(xué)特征——吸收、分布、代謝和排泄(Absorption，Distribution，Metabolism and Excretion，ADME)進(jìn)行初篩，查找4味中藥活性成分[4]。為標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息，統(tǒng)一在UniProt數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org)對化合物作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。同時(shí)根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)告補(bǔ)充未預(yù)測到的活性化合物的已知靶點(diǎn)。

1.2 蒼耳子散藥物活性成分與靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用Cytoscape 3.7.2圖像化軟件對生物活性成分及作用靶點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,其中用“節(jié)點(diǎn)(Node)”表示蒼耳子散藥物組成、活性成分、作用靶點(diǎn),用“邊(Edge)”表示節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)系[5]。同時(shí)應(yīng)用相關(guān)插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析,以明確蒼耳子散中關(guān)鍵活性成分和作用靶點(diǎn),最終目的為結(jié)合文獻(xiàn)分析其中的相互作用。

1.3 SAR相關(guān)靶基因篩選 以“seasonal allergic rhinitis”“SAR”為關(guān)鍵詞在人類基因信息數(shù)據(jù)庫(GeneCards,http://www,genecards.org)中篩選SAR相關(guān)作用靶點(diǎn)。并根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為SAR的潛在靶點(diǎn)。

1.4 蒼耳子散活性成分-SAR靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過PPI數(shù)據(jù)的構(gòu)建與挖掘,建立靶點(diǎn)的直接、間接調(diào)控作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò),從而更清晰地呈現(xiàn)藥物活性成分與靶點(diǎn)間的結(jié)合形式及重要節(jié)點(diǎn)的挖掘。

為探究蒼耳子散組方相關(guān)靶點(diǎn)與SAR靶點(diǎn)間的相互作用,首先應(yīng)用CytoScape 3.7.2中Bisogenet插件分別對2組靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”,身份識別導(dǎo)出類型設(shè)定為“gene identifiers only”,其余設(shè)置均為默認(rèn)設(shè)置,得到PPI網(wǎng)絡(luò)之后應(yīng)用merge工具對2組PPI進(jìn)行融合構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾寮﨏ytoNCA并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),連接度中心性(Degree Centrality,DC)、介度中心性(Betweenness Centrality,BC)、緊密中心性(Closeness Centrality,CC)、網(wǎng)絡(luò)中心性(Network Centrality,NC)和局部邊連通性(Localaverage Connectivity,LAC)等指標(biāo)進(jìn)行篩選,其中DC值大于所有節(jié)點(diǎn)DC值中位數(shù)2倍的節(jié)點(diǎn)為網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)(Hubnodes)。再篩選其他幾個(gè)指標(biāo)中大于中位數(shù)的節(jié)點(diǎn),即關(guān)鍵靶點(diǎn)。將關(guān)鍵靶點(diǎn)提交至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型,分析其參與的生物過程,并對其功能進(jìn)行描述[6]。

1.5 相關(guān)靶點(diǎn)生物學(xué)功能與信號通路的富集分析 將蒼耳子散活性成分靶點(diǎn)與SAR靶點(diǎn)取交集,并通過R語言繪制韋恩圖,得到共同靶點(diǎn)19個(gè)。應(yīng)用可視化和富集分子功能(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID)數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov)進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析,功能注釋聚類以及BioCarta和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路映射[7]。將19個(gè)靶基因輸入列表,標(biāo)識選擇“official-Gene-symbol”進(jìn)行分析,得到數(shù)據(jù)結(jié)果并進(jìn)行可視化處理。

1.6 蒼耳子散活性成分-SAR靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 運(yùn)用CytoScape 3.7.2構(gòu)建蒼耳子散活性成分-SAR靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖,利用CytoNCA分析活性成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù),包括DC、CC、NC等進(jìn)一步分析得到核心靶點(diǎn)及主要活性成分。

1.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1 動(dòng)物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級SD大鼠60只,雄性,12周齡,體質(zhì)量200～220 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0006,飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障動(dòng)物飼養(yǎng)室。飼養(yǎng)環(huán)境:大鼠按照組別分籠飼養(yǎng),房間內(nèi)每隔12 h進(jìn)行明暗交替,室內(nèi)溫度保持在18～22 ℃,相對濕度40%～60%,自由飲水和進(jìn)食。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。本研究通過倫理委員會審批(倫理審批號:JDF-IRB-2021031302)。

1.7.2 藥物 蒼耳子散顆粒劑組成:蒼耳子9 g、辛夷9 g、白芷15 g、薄荷3 g。購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司并提供質(zhì)量控制檢測,使用前采用沸水溶開至濃度1 g/mL,以便后續(xù)灌胃使用。

1.7.3 試劑與儀器 IgE酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)試劑盒(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司,貨號:A098542);白細(xì)胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)ELISA試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司,貨號:RF2481);γ干擾素(Interferon-Gamma,IFN-γ)ELISA試劑盒(上海聯(lián)祖生物科技有限公司,貨號:LZ-E030771);前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(Prostaglandin-endoperoxide Synthase,PTGS)2 ELISA試劑盒(上海滬震生物科技有限公司,貨號:HZ-1014);PTGS1 ELISA試劑盒(上海優(yōu)科唯生物科技有限公司,貨號:YKW-11129);蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)1 ELISA試劑盒(博爾森科技有限公司,貨號:YKW-11129);氫氧化鋁(上海麥克林生化科技有限公司,貨號:C10115726)。低溫離心機(jī)(安徽科大中佳,型號:LC-4016);酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司,型號:Thermo Scientific);恒溫水浴鍋(常州朗越儀器制造有限公司,型號:SYG-6);電子天平(常州奧豪斯儀器有限公司,型號:AX324ZH)。

1.7.4 方法

1.7.4.1 分組與模型制備 分組:正常對照組、模型對照組及蒼耳子散組,每組20只。模型制備:按文獻(xiàn)[8]造模方法制備變應(yīng)性鼻炎AR大鼠模型,共40只。基礎(chǔ)致敏階段:以150 mg卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)作為抗原,15 g氫氧化鋁粉末作為佐劑,混懸于50 mL 0.9%氯化鈉溶液中,作為致敏劑。采用腹腔注射法,每只大鼠1 mL,隔日1次,共進(jìn)行7次基礎(chǔ)致敏,用時(shí)14 d。正常對照組大鼠腹腔注射等容積的生理鹽水。局部刺激階段:第15～21天,采用滴鼻法,以2% OVA生理鹽水溶液滴入大鼠兩側(cè)鼻孔,每側(cè)50 μL,1次/d,正常對照組大鼠以等容積的生理鹽水進(jìn)行滴鼻。大鼠鼻部行為學(xué)癥狀總評分大于5分為變應(yīng)性鼻炎模型制備成功。

1.7.4.2 給藥方法 蒼耳子散組給予蒼耳子散顆粒3 mg/kg灌胃,模型對照組和正常對照組大鼠灌胃給予等容積的生理鹽水。2次/d,共灌胃14 d。

1.7.4.3 檢測指標(biāo)與方法 末次給藥1 h后,用10%水合氯醛麻醉,腹主動(dòng)脈取血5～10 mL,在離心管中靜置2 h后,于3 000 r/min離心機(jī)中離心10 min,離心半徑為10.06 cm,收集血清,于-20 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。檢測前取出,室溫環(huán)境下放置1 h后按照ELISA試劑盒說明書要求進(jìn)行處理,檢測大鼠血清中IgE、IL-4、IFN-γ、PTGS2、PTGS1、AKT1 mRNA含量。

2 結(jié)果

2.1 蒼耳子散組方活性成分初步篩選 共提取蒼耳子化學(xué)成分111個(gè)、辛夷化學(xué)成分184個(gè)、白芷化學(xué)成分223個(gè)、薄荷化學(xué)成分164個(gè),對ADME特征篩選后共獲得蒼耳子活性成分11個(gè)、辛夷活性成分19個(gè)、白芷活性成分22個(gè)、薄荷活性成分10個(gè)。見表1。蒼耳子作用靶點(diǎn)42個(gè)、辛夷作用靶點(diǎn)31個(gè)、白芷作用靶點(diǎn)40個(gè)、薄荷作用靶點(diǎn)68個(gè),合并后刪除重復(fù)值共得到靶點(diǎn)108個(gè)。

表1 蒼耳子散活性成分

2.2 蒼耳子散治療相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測與活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用網(wǎng)絡(luò)圖形化工具Cytoscape 3.7.2對上述生物活性成分及預(yù)測的作用靶點(diǎn)進(jìn)行關(guān)系網(wǎng)絡(luò)繪制和分析,得出節(jié)點(diǎn)共159個(gè),邊共473條。通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龃_定蒼耳子散發(fā)揮作用的生物活性成分主要為尼迪林(Cnidilin)、異二氫呋喃醌a(Isodihydrofutoquinol a)、加爾格雷芬(Galgravin)、木犀草素(luteolin)、腺苷醇c(Denudanolide c)、谷甾醇(Sitosterol)等,主要作用靶點(diǎn)為PTGS2、HSP90AB1、NCOA2、PTGS1、SCN5A、PIK3CG、DPP4、RXRA、CHRM1、AR、KCNH2、ESR1、GABRA1、β2-腎上腺素受體(Beta2-adrenergic Receptor,ADRB2)、PGR等。見圖1。

2.3 SAR相關(guān)靶點(diǎn)篩選 從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得SAR靶點(diǎn)628個(gè)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定Relevance大于中位數(shù)3.73的目標(biāo)靶點(diǎn)為SAR的潛在靶點(diǎn),最終得到320個(gè)SAR相關(guān)關(guān)鍵基因。

2.4 構(gòu)建蒼耳子散治療SAR的PPI網(wǎng)絡(luò)及獲取核心靶點(diǎn) 對藥物靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建得到5 055個(gè)節(jié)點(diǎn),126 097條邊,對疾病靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建得到6 183個(gè)節(jié)點(diǎn),142 213條邊。將結(jié)果應(yīng)用merge工具進(jìn)行融合構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),得到3 536個(gè)節(jié)點(diǎn)、97 200條邊的融合網(wǎng)絡(luò)(Merge Network)。通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾寮﨏ytoNCA分析得到結(jié)果,設(shè)定Degree值>2倍中位數(shù),篩選得到核心網(wǎng)絡(luò)。通過設(shè)定網(wǎng)絡(luò)中DC、BC、CC、LAC及NC>中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)得到核心作用靶點(diǎn)。見圖2。核心靶點(diǎn)輸入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫中再進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,分析其參與的生物過程并進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)功能描述。見表2。

表2 蒼耳子散-SAR靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)功能描述

2.5 相關(guān)靶點(diǎn)生物學(xué)功能與信號通路的富集分析 首先將蒼耳子散活性成分靶點(diǎn)與SAR靶點(diǎn)取交集,得到共同靶點(diǎn)19個(gè)。見圖3。應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因注釋富集分析,功能注釋聚類以及BioCarta&KEGG通路映射。結(jié)果可見多個(gè)靶點(diǎn)的功能與炎癥介質(zhì)及氧化應(yīng)激有關(guān)。其中蒼耳子散治療SAR主要參與的生物過程包括基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控(Negative Regulation of Gene Expression)、對缺氧的反應(yīng)(Response to Hypoxia)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的正調(diào)控(Positive Regulation of Endothelial Cell Proliferation)、

圖3 蒼耳子散成分-SAR靶點(diǎn)韋恩圖

胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular Signal-Regulated Kinase,Erk)1和Erk2級聯(lián)的負(fù)調(diào)控(Negative Regulation of Erk1 and Erk2 Cascade)、腫瘤壞死因子產(chǎn)生的負(fù)調(diào)控(Negative Regulation of Tumor Necrosis Factor Production)、前列腺素的生物合成過程(Prosta-glandin Biosynthetic Process)、炎癥反應(yīng)(Inflammatory Response)等。相關(guān)靶點(diǎn)調(diào)節(jié)Sar的功能主要富集于血紅素結(jié)合(Heme Binding)、前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶活性(Ptgs Activity)、雙加氧酶活性(Dioxygenase Activity)、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)劑的活性(Nitric-oxide Synthase Regulator Activity)、過氧化物酶活性(Peroxidase Activity)等。

參與的信號通路包括鈣信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF-1)信號通路、Toll樣受體信號通路、AMP活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase,AMPK)信號通路、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)信號通路、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)信號通路、叉頭盒O(Forkhead Box O,FoxO)信號通路等。見表3,圖4～5。

圖4 蒼耳子散治療SAR靶點(diǎn)的GO分析

圖5 蒼耳子散治療SAR靶點(diǎn)的KEEG分析

表3 蒼耳子散治療SAR靶點(diǎn)通路富集結(jié)果

2.6 蒼耳子散活性成分-SAR靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 運(yùn)用CytoScape 3.7.2構(gòu)建蒼耳子散活性成分-SAR靶點(diǎn)-關(guān)鍵信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。見圖6。應(yīng)用CytoScape 3.7.2內(nèi)置的Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù),得到核心的活性成分及核心作用靶點(diǎn)。結(jié)果提示前5位活性成分如下:柚皮苷、谷甾醇、木犀草素、阿沙西汀及蘆薈大黃素,活性成分相關(guān)的DC、BC及CC。見表4。

圖6 蒼耳子散成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

表4 蒼耳子散主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

PTGS2在網(wǎng)絡(luò)中的DC為44,BC為0.615 271 67,CC為0.609 022 56,預(yù)測PTGS2為蒼耳子散治療變應(yīng)性鼻炎SAR最主要靶點(diǎn)。PIK3CG、PTGS1、AKT1、TNF、ADRB2、表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)、IL1β亦為相對重要的靶點(diǎn)。見表5。

表5 蒼耳子主要活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

2.7 蒼耳子散對大鼠血清中IgE、IL-4、IFN-γ、PTGS2、PTGS1、AKT1 mRNA表達(dá)量的影響 模型對照組大鼠血清中IL-4、IgE、PTGS2、PTGS1、AKT1的含量明顯高于正常對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),蒼耳子散組大鼠血清中IL-4、IgE、PTGS2、PTGS1、AKT1水平均明顯低于模型對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與正常對照組比較,模型對照組大鼠血清中IFN-γ含量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),蒼耳子散組大鼠血清中IFN-γ較模型對照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 各組大鼠血清中IgE、IL-4、IFN-γ、PTGS2、PTGS1、AKT1 mRNA的表達(dá)比較

3 討論

SAR屬于中醫(yī)學(xué)“鼻鼽”范疇,是臨床常見病,如治療不及時(shí)可出現(xiàn)鼻息肉及哮喘等疾病。中藥復(fù)方在預(yù)防及治療季節(jié)性發(fā)作方面有獨(dú)特優(yōu)勢,尤其在改善鼻塞、流涕等癥狀方面擁有極大潛力。孫珊等[9]通過干祖望脫敏湯合蒼耳子散治療AR臨床觀察中發(fā)現(xiàn)純中醫(yī)組、純西醫(yī)組、中西醫(yī)結(jié)合組均為治療AR有效方法,中西醫(yī)結(jié)合組遠(yuǎn)期療效更優(yōu),證屬風(fēng)邪所致者均可本方加減治療。牛銀花和侯紅枝[10]通過玉屏風(fēng)合蒼耳子散治療持續(xù)性肺氣虛型AR發(fā)現(xiàn),玉屏風(fēng)和蒼耳子散能夠調(diào)節(jié)患者體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞因子失衡狀態(tài),緩解患者鼻黏膜炎癥反應(yīng),從而改善患者癥狀表現(xiàn)。王龍妹等[11]發(fā)現(xiàn),蒼耳子水煎液對細(xì)胞免疫作用明顯。另外,在AR豚鼠模型研究中發(fā)現(xiàn),蒼耳子水提取物可以改善AR豚鼠的過敏性癥狀,同時(shí)減輕AR豚鼠鼻黏膜的病理改變,降低血清中IL-4水平,升高IFN-γ的水平,從而調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子平衡,降低血清IgE水平,發(fā)揮療效[12]。

在臨床研究中發(fā)現(xiàn)肺氣失宣為鼻鼽主要病機(jī),《諸病源候論·鼻病諸侯》載:“肺氣通于鼻,其臟有冷,冷隨氣入乘于鼻,故使津涕不能自收。”故中醫(yī)認(rèn)為鼻鼽多因體虛衛(wèi)表不固,風(fēng)寒乘虛而入,上犯鼻竅,肺氣失宣,津液內(nèi)停,鼻竅壅塞,遂致鼻塞、噴嚏、流清涕[13]。另有研究認(rèn)為本病多分為以下4個(gè)證型:肺氣虛寒,衛(wèi)表不固;脾氣虛弱,清陽不升;腎陽不足,溫煦失職;肺經(jīng)伏熱,上犯鼻竅[14]。其中以肺氣虛寒為常見證型,治療原則以溫肺散寒、疏風(fēng)通竅為主。蒼耳子散出自《嚴(yán)氏濟(jì)生方》,為治療鼻科疾病的經(jīng)典方劑,文中所述:“辛夷仁半兩,蒼耳子兩錢半,香白芷一兩,薄荷葉半錢,上曬干,為細(xì)末,每服兩錢,食后用蔥、茶清調(diào)下。”現(xiàn)代則多以湯劑蔥茶調(diào)服。方中蒼耳子、辛夷發(fā)散風(fēng)寒,通鼻竅,蒼耳子兼祛風(fēng)濕;白芷祛風(fēng)、燥濕、消腫、止痛。薄荷性味辛涼,疏散風(fēng)熱,清利頭目,防止辛溫藥助陽太過。組方主治肺氣虛寒證的鼻鼽患者,亦可配伍健脾益腎,或清熱涼血藥治療其他證型的患者,發(fā)揮其疏風(fēng)通竅的功效。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對蒼耳子散治療SAR的關(guān)鍵活性成分進(jìn)行分析,提示主要活性成分為柚皮苷、谷甾醇、木犀草素等。AR相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)研究表明,柚皮苷腹腔注射能顯著抑制OVA致敏模型小鼠的氣道高反應(yīng)性和氣道重塑,抑制支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid,BALF)中IL-4、IL-13水平升高及核因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)的活化[15]。谷甾醇是一種天然植物,具有抗炎活性,能夠顯著抑制TNF-α、IL-6、IL-1β、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)和環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)等炎癥介質(zhì)的表達(dá),并下調(diào)抗炎細(xì)胞因子(IL-10)的表達(dá)。同時(shí)抑制p-IκB-α激活和p38促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogenactivated Protein Kinase,MAPK)的表達(dá)[16]。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)木犀草素通過MAPK和NF-κB信號通路抑制IL-33刺激的肥大細(xì)胞中IL-31的產(chǎn)生,抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)通路MAPK和NF-κB的活化[17]。

本研究結(jié)果表明,蒼耳子散治療SAR的靶點(diǎn)主要集中在PTGS2,而PIK3CG、PTGS1、AKT1、TNF、ADRB2、EGFR、IL1β亦為重要的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。PTGS是生物活性脂類調(diào)節(jié)物包括前列腺素、血栓烷和前列環(huán)素等各家族的前體。PTGS1和PTGS2都是膜整合蛋白。人PTGS2基因則被定位于1q25.2～25.3,約為8.3 kb大小,包含10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子,且外顯子10顯著大于外顯子1～9,包含410 bp編碼區(qū)和全長為2 550 bp的3′非翻譯區(qū)。前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)的形成高度依賴于這些細(xì)胞中PTGS2的表達(dá)。TNF-α通過TNF通路能夠誘導(dǎo)PTGS2的產(chǎn)生,其作用機(jī)制為TNF-α增加了PTGS2基因的轉(zhuǎn)錄。另一方面,IL-4抑制PTGS2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá),以及類前列腺素的產(chǎn)生[18]。通過對藥物和疾病融合后的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行GO功能富集分析顯示,蒼耳子散能夠通過調(diào)控mRNA代謝過程、調(diào)控基因表達(dá)、核酸代謝過程、含核堿基的化合物代謝過程對SAR發(fā)揮作用。在對相關(guān)通路富集分析研究中發(fā)現(xiàn)蒼耳子散調(diào)治SAR中,重要的通路包括鈣信號通、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、AMPK信號通路、TNF信號通路、VEGF信號通路、FoxO信號通路等。HIF-1α直接介導(dǎo)iNOS和VEGF的轉(zhuǎn)錄,從而誘導(dǎo)血管通透性和炎癥反應(yīng),抑制HIF-1α改善了氣道中的過敏表型[19-20]。此外,HIF-1α抑制后,氣道高反應(yīng)性顯著降低[21]。Toll樣受體信號通路與AR的研究亦發(fā)現(xiàn),引起AR的Toll樣受體TLR(Toll-like Receptor,TLR)主要為TLR2、TLR4及TLR9,NF-κB是TLRs下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,NF-κB以p50和p65組成的二聚體形式發(fā)揮作用,激活核內(nèi)相關(guān)轉(zhuǎn)錄過程,使炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子表達(dá)增多,促進(jìn)大量炎癥反應(yīng),同時(shí)誘導(dǎo)Th2表達(dá)細(xì)胞因子,導(dǎo)致Th1及Th2細(xì)胞因子失衡發(fā)生AR。另外,我們通過VOA大鼠AR模型進(jìn)行靶點(diǎn)驗(yàn)證,研究發(fā)現(xiàn)蒼耳子散可調(diào)節(jié)AR相關(guān)介質(zhì)IgE、IL-4、IFN-γ的表達(dá),且蒼耳子散治療后PTGS2、PTGS1、AKT1藥物靶點(diǎn)的mRNA表達(dá)較模型對照組均有顯著差異。

研究結(jié)果表明蒼耳子散中各活性成分可對不同靶點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控,而各個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)又可介導(dǎo)不同的生物過程與信號通路,其與中醫(yī)藥治療疾病多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)不謀而合。在應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中,我們初步探究了蒼耳子散治療SAR的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),為臨床運(yùn)用提供了一定依據(jù)。本研究的不足之處在于應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)指標(biāo)和靶點(diǎn),為療效評價(jià)提供指標(biāo),盡早服務(wù)于臨床。

利益沖突聲明:無。