付冠軍, 黃 聰, 周亞楠, 劉 博, 劉萬學(xué), 錢萬強(qiáng), 萬方浩*

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組研究所,廣東 深圳 518120; 2青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院,山東 青島 266109; 3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193

自然環(huán)境中存在十分復(fù)雜的化學(xué)信息,昆蟲能夠利用其敏銳的嗅覺系統(tǒng)感受環(huán)境中的各種氣味信息,并對其做出相應(yīng)的生理響應(yīng)和行為反應(yīng),例如覓食、求偶、寄主定位、躲避天敵和定位產(chǎn)卵場所等(婁永根和程家安,2001; 王桂榮等,2004)。利用氣味信息干擾昆蟲正常的行為活動(dòng)是害蟲綠色防控的手段之一,與化學(xué)農(nóng)藥相比,以氣味化合物為活性物質(zhì)的昆蟲行為調(diào)節(jié)劑具有環(huán)境友好及抗性發(fā)展緩慢等特點(diǎn)(楊斌等,2020)。目前,昆蟲行為調(diào)節(jié)劑活性物質(zhì)的來源主要包括昆蟲自身通過腺體釋放的信息素以及寄主植物所釋放的化合物(閆鳳鳴等,2013)。明確對昆蟲具有行為調(diào)控活性的化合物是昆蟲行為調(diào)節(jié)劑開發(fā)的關(guān)鍵,過去實(shí)現(xiàn)這一目的主要借助于一系列生物測定的方法,例如:利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatograph-mass spectrometer, GC-MS)進(jìn)行昆蟲生境中化學(xué)信息的成分鑒定;氣相色譜觸角電位聯(lián)用(gas chromatography-electro antenna graphic detection, GC-EAD)、觸角電位反應(yīng)(electro antenna graphy, EAG)等技術(shù)驗(yàn)證昆蟲對特定化合物刺激是否產(chǎn)生電生理響應(yīng);Y型嗅覺儀等行為活性測試裝置驗(yàn)證目標(biāo)化合物對昆蟲行為的影響(尹海辰等, 2020);爪蟾卵母細(xì)胞、人類胚胎腎細(xì)胞以及果蠅空神經(jīng)元等異源表達(dá)系統(tǒng)(Bengtssonetal.,2014; Grosse-Wildeetal.,2007; Liuetal.,2014; Sakuraietal.,2004)或RNAi、CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)(Chenetal.,2020; Guoetal.,2020)來確定活性成分及其作用的分子靶標(biāo)。然而,由于昆蟲生境中的化學(xué)信息種類繁多,加上生物測定方法工作流程繁瑣、耗時(shí)耗力,亟需發(fā)展一種新的方法并輔助傳統(tǒng)方法進(jìn)行活性化合物的篩選,進(jìn)而提高昆蟲行為調(diào)節(jié)劑先導(dǎo)化合物的篩選效率。

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的迅速發(fā)展,基于計(jì)算機(jī)的藥物虛擬篩選為實(shí)現(xiàn)高通量篩選提供了可靠的解決方案,顯著提高了先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)效率(劉軻等,2018; 劉潤哲等,2021)。近年來,昆蟲嗅覺分子機(jī)制研究的不斷深入、昆蟲嗅覺信息數(shù)據(jù)化程度的不斷提高,使得通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行昆蟲行為調(diào)節(jié)劑先導(dǎo)化合物篩選成為可能,極大地推動(dòng)了昆蟲行為調(diào)節(jié)劑開發(fā)的進(jìn)程。目前,基于計(jì)算機(jī)的昆蟲行為調(diào)節(jié)劑虛擬篩選主要有以下2種策略(劉潤哲等,2021):一是以理論計(jì)算為依據(jù),基于配體的虛擬篩選,其設(shè)計(jì)思路是通過計(jì)算分析已知活性化合物的分子特征,采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法揭示化合物分子特征與其活性之間的定量變化規(guī)律,即定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(quantitative structure-activity relationship, QSAR);二是以分子對接為理論,基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選,其設(shè)計(jì)思想是通過計(jì)算機(jī)模擬蛋白質(zhì)與小分子的結(jié)合模式,根據(jù)蛋白質(zhì)與配體結(jié)合特征和結(jié)合自由能判斷結(jié)合強(qiáng)度。

在昆蟲嗅覺識別過程中,氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins, OBP)負(fù)責(zé)將進(jìn)入嗅覺感器的氣味化合物分子運(yùn)輸至嗅覺感受神經(jīng)元表面的氣味受體(olfactory receptors, OR)和氣味共受體(odorant receptor coreceptors, Orco)組成的復(fù)合體中,從而實(shí)現(xiàn)對氣味分子的特異性識別(李慧等,2021; Zhaoetal.,2018)。因此,OBP與OR家族在昆蟲與化學(xué)信息相互作用的研究中被重點(diǎn)關(guān)注。OBP為水溶性蛋白,相比于跨膜蛋白OR更容易獲得晶體結(jié)構(gòu)(Venthur &Zhou,2018),在先前的昆蟲行為調(diào)節(jié)劑虛擬篩選研究中,OBP的潛在配體的預(yù)測常采用基于結(jié)構(gòu)的篩選方法(李敏等,2019),OR氣味反應(yīng)譜的預(yù)測則多采用基于配體的虛擬篩選策略。

1 基于配體的昆蟲行為調(diào)節(jié)劑虛擬篩選

基于配體的虛擬篩選策略以一系列通過實(shí)驗(yàn)確定的嗅覺數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),通過建立能夠正確擬合配體分子與受體蛋白結(jié)合活性關(guān)系的QSAR模型從化合物庫中高通量篩選潛在的活性化合物(劉軻等,2018)。其一般流程如圖1所示:第一步,數(shù)據(jù)獲取,研究人員需針對不同的任務(wù)從文獻(xiàn)或?qū)I(yè)數(shù)據(jù)庫中收集相應(yīng)的嗅覺數(shù)據(jù)信息(Sharmaetal.,2022),其數(shù)量和質(zhì)量往往直接影響模型的預(yù)測性能(Affonsoetal., 2013),因此,收集的數(shù)據(jù)盡可能全面、準(zhǔn)確;第二步,數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換,由于獲取的嗅覺信息一般是受體和其對應(yīng)的配體,計(jì)算機(jī)無法直接處理這類數(shù)據(jù),因此,需要將受體和配體的理化特性轉(zhuǎn)換為計(jì)算機(jī)可讀的數(shù)據(jù)形式,且盡可能完整、有效地代表固有信息;第三步,模型訓(xùn)練與評估,對轉(zhuǎn)化后的數(shù)據(jù)劃分訓(xùn)練集和測試集,利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法對訓(xùn)練集進(jìn)行訓(xùn)練構(gòu)建受體和配體分子的定量構(gòu)效關(guān)系,并利用測試集評估模型質(zhì)量;第四步,化合物篩選,訓(xùn)練獲得高質(zhì)量的預(yù)測模型之后,即可利用模型預(yù)測未知受體與配體的結(jié)合能力(劉潤哲等,2021)。

圖1 基于配體的藥物篩選基本流程

1.1 數(shù)據(jù)獲取與處理

獲取嗅覺受體的反應(yīng)譜數(shù)據(jù)是開發(fā)QSAR模型的關(guān)鍵,數(shù)據(jù)來源有以下2個(gè)方面:1)嗅覺信息數(shù)據(jù)庫,如DoOR (http:∥neuro.uni-konstanz.de/DoOR)數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)收錄了黑腹果蠅Drosophilamelanogaster幾乎所有的氣味受體反應(yīng)譜數(shù)據(jù),涉及693種氣味化合物(Munch &Galizia,2016);2)大量未收錄在專業(yè)數(shù)據(jù)庫但已報(bào)道的嗅覺反應(yīng)數(shù)據(jù)(Chenetal.,2020; Guoetal.,2021; Miuraetal.,2010)。

分子特征表示作為分子化學(xué)信息的數(shù)學(xué)表示使得計(jì)算機(jī)對化學(xué)信息的處理更為方便,常用分子特征表示方法主要有分子描述符、分子指紋、簡化分子線性輸入規(guī)范(simplified molecular input line entry system, SMILES),在QSAR研究中以分子描述符和分子指紋較為常見。Mordred (Moriwakietal.,2018)、PaDEL-Descriptor (Yap,2011)、CDK (Steinbecketal.,2003)、RDKit、Dragon和alvaDesc (Mauri,2020)等工具都可實(shí)現(xiàn)由分子化學(xué)信息向其數(shù)學(xué)表示的轉(zhuǎn)換,盡管在數(shù)量和表示類型上不盡相同,但其最終目標(biāo)都是盡可能有效、全面地提供分子特征的數(shù)學(xué)表示,幾種常見計(jì)算工具及其提供的分子特征數(shù)量見表1。然而,上述工具中部分存在軟件配置困難或停止維護(hù)的情況,開源在線服務(wù)平臺ChemDes (http:∥www.scbdd.com/chemdes)集成了多個(gè)分子特征計(jì)算工具,例如Chemopy、CDK、RDKit等,用戶只需選擇對應(yīng)的計(jì)算工具并提交SMILES信息或上傳分子結(jié)構(gòu)文件即可得到分子特征,大大減少軟件配置等問題(Dongetal.,2015)。

表1 分子描述符計(jì)算工具

1.2 機(jī)器學(xué)習(xí)與虛擬篩選

機(jī)器學(xué)習(xí)是人工智能的重要分支,能夠通過特定算法擬合真實(shí)數(shù)據(jù)形成對人類經(jīng)驗(yàn)的模仿,算法作為機(jī)器學(xué)習(xí)的核心對于“經(jīng)驗(yàn)?zāi)７隆本哂兄匾饬x。Scikit-learn、PyTorch、TensorFlow (劉潤哲等,2021)等開源科學(xué)計(jì)算庫的發(fā)展,大大降低了編程難度,極大方便了科研人員對計(jì)算生物學(xué)的應(yīng)用。根據(jù)算法處理數(shù)據(jù)機(jī)制的不同,機(jī)器學(xué)習(xí)算法分為傳統(tǒng)機(jī)器學(xué)習(xí)算法和深度學(xué)習(xí)算法,相比于傳統(tǒng)機(jī)器學(xué)習(xí)算法,深度學(xué)習(xí)算法通過模擬人腦的神經(jīng)機(jī)制強(qiáng)調(diào)模型對數(shù)據(jù)更深入的理解。

人們通過異源表達(dá)系統(tǒng)研究明確了大量極具價(jià)值的嗅覺編碼信息,為利用機(jī)器學(xué)習(xí)方法研究嗅覺受體的化學(xué)感受譜提供基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)支撐。例如,Kepchiaetal.(2019)將岡比亞按蚊AnophelesgambiaeGiles氣味共受體ORco的83個(gè)配體結(jié)合數(shù)據(jù)(58個(gè)拮抗劑和25個(gè)非拮抗劑)的拓展連接指紋(extended connectivity fingerprints, ECFP)作為分子特征輸入,并選擇樸素貝葉斯分類算法(naive bayesian)對輸入的數(shù)據(jù)集進(jìn)行擬合,在對1280種氣味分子進(jìn)行虛擬篩選中發(fā)現(xiàn)了一種具有全新結(jié)構(gòu)的氣味分子2-tert-butyl-6-methylphenol (BMP)與ORco具有較好的結(jié)合活性,進(jìn)一步利用電生理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了BMP的生物學(xué)效應(yīng),為ORco拮抗劑的開發(fā)提供了新的方法。然而,受限于高度差異的昆蟲氣味受體以及嗅覺數(shù)據(jù)解析程度,基于配體的昆蟲行為調(diào)節(jié)劑篩選策略主要應(yīng)用于雙翅目(Boyleetal.,2013,2016; Guptaetal.,2021; Oliferenkoetal.,2013; Tauxeetal.,2013),2020年,Caballero-Vidaletal.(2020)首次將這一策略擴(kuò)展到鱗翅目昆蟲?；页嵋苟闟podopteralittoralis(Boisduval)的氣味受體功能研究中,應(yīng)用支持向量機(jī)(support vector machine, SVM)算法對氣味受體SlitOR25的氣味反應(yīng)數(shù)據(jù)(13個(gè)活性數(shù)據(jù)和39個(gè)非活性數(shù)據(jù))的分子特征和標(biāo)簽進(jìn)行擬合,對3306282個(gè)分子進(jìn)行虛擬篩選以發(fā)現(xiàn)其全新的配體,選擇32種具有潛在活性的化合物進(jìn)行功能驗(yàn)證,揭示了11種具有生物學(xué)活性的配體分子。

2 基于結(jié)構(gòu)的昆蟲行為調(diào)節(jié)劑虛擬篩選

在結(jié)構(gòu)生物學(xué)的推動(dòng)下,研究人員通過特定的算法解析蛋白受體與配體分子在原子水平上的相互作用方式來推動(dòng)先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)及篩選效率(劉軻等,2018)?；诮Y(jié)構(gòu)的虛擬篩選依賴于靶標(biāo)蛋白和配體分子的三維結(jié)構(gòu),通過空間匹配和能量優(yōu)化分析活性位點(diǎn)、預(yù)測受體和配體結(jié)合的優(yōu)勢構(gòu)象,從而確定與受體蛋白具有結(jié)合能力的潛在配體。因此,基于結(jié)構(gòu)的篩選主要是通過分子對接技術(shù)的數(shù)據(jù)庫搜尋,即將數(shù)據(jù)庫中的分子依次對接到靶標(biāo)蛋白的活性口袋,通過構(gòu)象搜索算法不斷優(yōu)化分子與受體氨基酸側(cè)鏈、骨架結(jié)合的構(gòu)象,并結(jié)合打分函數(shù)評估結(jié)合親和性(圖2)。

圖2 基于結(jié)構(gòu)的藥物篩選流程

2.1 受體和配體的三維結(jié)構(gòu)

隨著后基因組時(shí)代的到來,結(jié)構(gòu)生物學(xué)已成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn),蛋白質(zhì)作為生命過程發(fā)揮生物學(xué)功能的主要大分子物質(zhì)被廣泛關(guān)注。核磁共振技術(shù)(nuclear magnetic resonance)、X 射線晶體衍射法(X ray crystalline diffraction)以及冷凍電鏡技術(shù)(cryo-electron microscopy)作為解析蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的主要手段(徐顥溪和劉磊,2020),奠定了結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的基礎(chǔ),目前已有191565個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)收納于PDB數(shù)據(jù)庫(https:∥www.rcsb.org)。盡管如此,隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,蛋白質(zhì)序列呈井噴式增加,通過實(shí)驗(yàn)解析蛋白晶體結(jié)構(gòu)已無法滿足當(dāng)前科研發(fā)展的需求,科學(xué)家將目光逐漸移向基于序列信息的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(Dengetal. 2016),經(jīng)過半個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展,以Swiss-model、Modeller和I-Tasser為代表的同源建模和以AlphaFold2、Rosetta為代表的從頭建模策略均在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測的準(zhǔn)確性和精度方面取得了巨大成功。值得一提的是,AlphaFold2在2020年第14屆國際蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測評估大賽(Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction, CASP)中斬獲頭籌(劉子楠等,2020)。

受體蛋白與配體的結(jié)合能力決定了昆蟲對氣味配體的識別,是引起昆蟲行為變化的主要原因之一,因此,在分子對接研究中,獲得精確的受體蛋白和配體分子的三維結(jié)構(gòu)同等重要。相較于受體蛋白的三維結(jié)構(gòu),配體小分子的三維結(jié)構(gòu)更易獲得,如由美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health, NIH)開發(fā)的化學(xué)分子數(shù)據(jù)庫ChemBank (https:∥pubchemdocs.ncbi.nlm.nih.gov/)存儲了1607755個(gè)分子的結(jié)構(gòu)信息以供用戶免費(fèi)下載,由美國加州大學(xué)舊金山分校(University of California, San Francisco, UCSF)藥物化學(xué)系的Irwin和Shoichet實(shí)驗(yàn)室提供和維護(hù)支持的ZINC (https:∥zinc15.docking.org/)包含2.3億個(gè)市場上可購買的化合物3D結(jié)構(gòu)。

2.2 分子對接與虛擬篩選

自1894年Fischer提出蛋白和配體結(jié)合的“鎖-鑰模型”以來,分子對接技術(shù)發(fā)展迅速,目前,已有超過60種分子對接工具,例如:Dock、AutoDock、Gold、Glide、Moe Dock、AutoDock Vina等(Pagadalaetal.,2017)。基于結(jié)構(gòu)虛擬篩選由于不受目的嗅覺蛋白化學(xué)感受范圍解析程度的影響,應(yīng)用更為廣泛。例如:Thireouetal. (2018)在篩選岡比亞按蚊新型趨避劑的研究中,依據(jù)性狀相似和化學(xué)相似性對42755個(gè)合成分子進(jìn)行篩選,確定了33個(gè)與已知驅(qū)蚊劑相似的分子,使用AutoDock軟件的拉馬克遺傳算法(Lamarckian genetic algorithm, LGA)將其與AgamOBP1晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行對接構(gòu)象搜索,選擇對接結(jié)果較好的16個(gè)分子對其進(jìn)行功能驗(yàn)證,其中4個(gè)化合物能與AgamOBP1結(jié)合且具有趨避活性。Yietal. (2015)對斜紋夜蛾SpodopteralituraFabricius氣味結(jié)合蛋白OBP1進(jìn)行同源建模,并在CHARMM力場下對其初始結(jié)構(gòu)分別執(zhí)行梯度下降(steepest descend)和共軛梯度(conjugate gradient)能量最小化程序檢查模型質(zhì)量,在對接篩選中,先使用Ligandfit工具的蒙特卡羅法和能量網(wǎng)格對Available Chemicals Directory 數(shù)據(jù)庫中的1536550種化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行首輪對接,隨后用Cdocker工具進(jìn)行二次對接,并根據(jù)PLP1、Ligscore1 2種評分函數(shù)對復(fù)合物結(jié)合穩(wěn)定性進(jìn)行排序,選擇對接合理的2040個(gè)化合物中的21個(gè)具有不同結(jié)構(gòu)和結(jié)合模式的化合物進(jìn)行熒光競爭結(jié)合分析,其中15個(gè)化合物均與OBP1具有良好的結(jié)合活性。分子對接研究在昆蟲行為調(diào)節(jié)劑虛擬篩選研究中涉及雙翅目、膜翅目、半翅目、鱗翅目、鞘翅目等類群,如表2所示。

表2 分子對接在昆蟲行為調(diào)節(jié)劑研究中的應(yīng)用

3 討論與展望

基于配體和基于結(jié)構(gòu)的2種虛擬篩選都能促進(jìn)先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)進(jìn)程,然而2種方法各有優(yōu)劣,基于配體的虛擬篩選要求具備一定的編程基礎(chǔ),研究門檻相對較高,且模型開發(fā)過程繁瑣,從模型設(shè)計(jì)到模型應(yīng)用的時(shí)間較長,但運(yùn)行速度較快,擬合好模型之后可短時(shí)間內(nèi)完成對海量化合物的預(yù)測任務(wù);基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選往往借助于可視化的研究工具,研究門檻相對較低,能夠在短時(shí)間內(nèi)快速上手應(yīng)用,但運(yùn)行速度遠(yuǎn)低于基于配體的篩選方法。

在昆蟲的行為調(diào)節(jié)劑的先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)研究中,基于配體的虛擬篩選:1)側(cè)重于廣譜性嗅覺受體蛋白,且嚴(yán)重依賴于嗅覺編碼解析程度,無法對調(diào)諧范圍較窄以及功能不明確的嗅覺受體蛋白進(jìn)行研究;2)現(xiàn)有的嗅覺反應(yīng)數(shù)據(jù)僅涉及與昆蟲生境關(guān)系密切的氣味化合物分子,僅代表了自然界中龐大且復(fù)雜化學(xué)信息庫中的一小部分,且未經(jīng)生物學(xué)功能測試的化合物無法對其是否具有活性做出定論,因此,在一定程度上限制了模型訓(xùn)練數(shù)據(jù)的多樣性和模型泛化能力;3)僅有少數(shù)模式物種的嗅覺反應(yīng)信息以高度集中的數(shù)據(jù)庫形式存在,因此,對于非模式物種的氣味反應(yīng)數(shù)據(jù),需要研究人員花費(fèi)大量的時(shí)間和精力從海量文獻(xiàn)中收集獲得。ODORactor 數(shù)據(jù)庫提供了大量哺乳動(dòng)物的OR反應(yīng)譜信息,并以此開發(fā)了小分子配體預(yù)測功能(Liuetal.,2011),極大程度上促進(jìn)了大數(shù)據(jù)的利用。隨著昆蟲化學(xué)生態(tài)領(lǐng)域數(shù)據(jù)化研究的不斷深入,構(gòu)建嗅覺反應(yīng)數(shù)據(jù)庫和利用計(jì)算生物學(xué)的方法預(yù)測嗅覺反應(yīng)譜是未來研究受體與配體結(jié)合關(guān)系的趨勢,對掌握昆蟲的化學(xué)感受譜以及應(yīng)用具有深遠(yuǎn)意義。

基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選:1)對接打分函數(shù)能夠直接影響研究人員對結(jié)果的分析判斷,然而現(xiàn)有的評分函數(shù)對蛋白受體與配體的結(jié)合能力評價(jià)準(zhǔn)確性仍有待提高,在未來很長一段時(shí)間,需要依賴大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對評分函數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,進(jìn)一步提高對接結(jié)果在正常生理狀態(tài)下的表現(xiàn)能力及其評估精度;2)分子對接的準(zhǔn)確與否與蛋白三維結(jié)構(gòu)的精度密切相關(guān),蛋白建模雖然在一定程度上彌補(bǔ)了通過實(shí)驗(yàn)方法解析蛋白晶體結(jié)構(gòu)的短板,但仍有部分蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測達(dá)不到應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)(劉子楠等,2020);3)計(jì)算機(jī)模擬無法完全體現(xiàn)生物大分子與小分子在正常生理狀態(tài)下的結(jié)合模式,因此,分子對接的準(zhǔn)確性一直備受關(guān)注,完成分子對接后往往需要人們進(jìn)一步基于先驗(yàn)知識進(jìn)行判斷,或利用微量熱涌動(dòng)、熒光競爭結(jié)合等手段驗(yàn)證其準(zhǔn)確性(李敏等,2019; 劉航瑋等,2017),盡管如此,該技術(shù)仍然大大降低了篩選的盲目性。隨著實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)豐度的不斷上升和算法不斷優(yōu)化,分子對接的準(zhǔn)確性將會進(jìn)一步提高,基于結(jié)構(gòu)的昆蟲行為調(diào)節(jié)劑研究將會進(jìn)一步發(fā)展。