曹強(qiáng) ，郭亞菲 ，葉蕾蕾 ，張成園 ，寇仁博 ，王志旺，，郭玫，

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

中藥指紋圖譜是一種綜合、可量化的色譜鑒定手段，可以比較全面地反映中藥材及制劑的化學(xué)成分及特征，進(jìn)而評價(jià)其質(zhì)量穩(wěn)定性及一致性。中藥譜效關(guān)系是建立在指紋圖譜基礎(chǔ)上，將指紋圖譜和藥效學(xué)通過化學(xué)計(jì)量學(xué)模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)，建立綜合評價(jià)化學(xué)成分與藥效活性為一體的質(zhì)量評價(jià)模式，能夠揭示化學(xué)成分與藥效之間的相關(guān)性，指導(dǎo)和推進(jìn)中藥活性物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，為提升中藥的內(nèi)在品質(zhì)提供保障，近年來廣泛用于中藥和復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究[1-3]。

大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim. ex Balf或藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根及根莖，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃功效[4]。現(xiàn)代研究表明，大黃主要含有蒽醌、蒽酮、鞣質(zhì)、二苯乙烯、黃酮、多糖等多種化學(xué)成分，具有瀉下、抗炎、抗腫瘤、保肝、保護(hù)心血管等藥理作用[5-8]。目前已有關(guān)于大黃醇提取物或大黃中單一成分抗炎活性的研究，但尚未從整體化學(xué)組分水平研究其抗炎相關(guān)性物質(zhì)，無法全面、系統(tǒng)地表征唐古特大黃抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)檢測唐古特大黃甲醇提取物及不同極性部位體外抗炎的生物活性，將HPLC指紋圖譜與體外藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合，采用偏最小二乘回歸法（partial least squares regression，PLSR）對譜效關(guān)系進(jìn)行研究，考察唐古特大黃甲醇提取物及其不同極性部位萃取物HPLC指紋圖譜特征峰與體外炎癥因子抑制作用的相關(guān)性，確定各成分對藥效的貢獻(xiàn)，以期闡明唐古特大黃抗炎作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)一步得到其抗炎有效部位，為唐古特大黃抗炎藥效物質(zhì)辨識與質(zhì)量控制模式的建立提供依據(jù)。

1 儀器、試藥與細(xì)胞

Agilent1260型高效液相色譜儀，美國Agilent Technologies公司；BT125D電子分析天平（十萬分之一），賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ-700DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Benchmark plus型酶標(biāo)儀，上海新振儀器設(shè)備有限公司；IX53倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；371型二氧化碳培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；IC1000型Countstar自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，上海睿鈺生物科技有限公司。

唐古特大黃藥材，2017年秋于甘肅甘南州合作市采集，經(jīng)甘南科技開發(fā)交流中心甘玉偉農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣研究員鑒定為蓼科植物唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim. ex Balf的干燥根及根莖。

RAW264.7專用培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS+1%P/S，批號WH01112202XP28），武漢普諾賽生命科技有限公司；蘆薈大黃素（批號531B024，純度98%）、大黃酸（批號109C021，純度98%）、大黃素（批號1205A0210，純度98%）、大黃酚（批號523D025，純度98%）、大黃素甲醚（批號718C023，純度98%）、沒食子酸（批號725G028，純度98%）、(±)-兒茶素（批號1124H021，純度98%），北京索萊寶科技有限公司；番瀉苷A（批號AF9111318，純度98%）、番瀉苷B（批號AF9111319，純度98%），成都埃法生物科技有限公司；脂多糖（批號820F036）、噻唑藍(lán)（MTT，批號917Q054）、二甲基亞砜（DMSO，批號1121E0324），Solarbio公司；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

RAW264.7細(xì)胞株（批號WXAKX9OB0N，武漢普諾賽生命科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 唐古特大黃不同部位制備

稱取唐古特大黃藥材粉末（過4號篩）10 g，加甲醇（料液比1∶50），（30±5）℃超聲提取（功率350 W，頻率20 kHz）1 h，過濾，濾液40 ℃水浴蒸干，得甲醇總提取物。用水復(fù)溶，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取至近無色，合并各自萃取液，40 ℃水浴蒸干，得唐古特大黃甲醇總部位（A）、石油醚部位（B）、二氯甲烷部位（C）、乙酸乙酯部位（D）和水部位（E）。將干燥粉末置于干燥器中保存，備用。

2.2 指紋圖譜建立

2.2.1 供試品溶液制備

3.切實(shí)發(fā)揮好四個(gè)作用。黨員領(lǐng)導(dǎo)干部在市場開拓中要發(fā)揮好“管理協(xié)調(diào)”作用，在經(jīng)營創(chuàng)收中要發(fā)揮好“引領(lǐng)激勵(lì)”作用，在安全穩(wěn)定中要發(fā)揮好“控制防范”作用，在精細(xì)管理中要發(fā)揮好“執(zhí)行表率”作用。切實(shí)引導(dǎo)全體干部員工把思想?yún)R聚到打造一流上、智慧集聚到打造一流上、力量凝聚到打造一流上，切實(shí)為公司發(fā)展挑重?fù)?dān)、負(fù)責(zé)任，為員工當(dāng)先鋒、作表率。

取唐古特大黃5個(gè)不同部位（A～E）各約0.005 g，精密稱定，甲醇超聲溶解并定容至5 mL，得1 mg/mL溶液，過濾，即得供試品溶液A～E。

2.2.2 對照品溶液制備

精密稱取大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、(±)-兒茶素、沒食子酸，番瀉苷A及番瀉苷B對照品適量，配制成1 mg/mL的對照溶液，各吸取1 mL于10 mL容量瓶中，得混合對照品溶液。

2.2.3 色譜條件

采用AgilentTC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～6 min，10%～30%A；6～13 min，30%～33%A；13～21 min，33%～37%A；21～25 min，37%～40%A；25～35 min，40%～45%A；35～45 min，45%～48%A；45～49 min，48%～52%A；49～54 min，52%～60%A；54～64 min，60%～95%A；64～74 min，95%～10%A；74～78 min，10%～10%A），流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長280 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2.4 精密度試驗(yàn)

分別精密量取供試品溶液A～E適量，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各色譜圖上分離度較好、響應(yīng)值較高的色譜峰保留時(shí)間和峰面積RSD，結(jié)果RSD＜3.0%，表明儀器的精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別精密量取供試品溶液A～E適量，于0、2、4、6、8、12 h按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件檢測，計(jì)算各色譜圖上分離度較好、響應(yīng)值較高的色譜峰保留時(shí)間和峰面積RSD，結(jié)果RSD＜3.0%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密稱取A～E樣品適量，各平行6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件檢測，計(jì)算各色譜圖上分離度較好、響應(yīng)值較高的色譜峰保留時(shí)間和峰面積RSD，結(jié)果RSD＜3.0%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.2.7 HPLC圖譜特征色譜峰標(biāo)定

分別取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件分別連續(xù)進(jìn)樣3次，進(jìn)行HPLC圖譜分析，對分離度較好、出峰較穩(wěn)定的色譜峰進(jìn)行標(biāo)定，相同保留時(shí)間下的色譜峰記為同一峰號，在同一時(shí)間沒有峰的部位記為0。

唐古特大黃各部位的特征峰峰面積結(jié)果見表1。經(jīng)與對照品比對，指認(rèn)1號峰為沒食子酸，2號峰為兒茶素，11號峰為番瀉苷B，14號峰為番瀉苷A，23號峰為蘆薈大黃素，27號峰為大黃酸，28號峰為大黃素，29號峰為大黃酚，30號峰為大黃素甲醚。對照品及供試品HPLC圖見圖1、圖2。

圖2 唐古特大黃各部位HPLC圖

表1 唐古特大黃不同極性部位HPLC圖特征峰峰面積

2.3 體外抗炎實(shí)驗(yàn)

2.3.1 細(xì)胞處理

RAW264.7細(xì)胞于37 ℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)于專用培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期的細(xì)胞懸液，以200 μL（2×105個(gè)/孔）接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)12 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 唐古特大黃不同部位對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

實(shí)驗(yàn)分為空白組、正常組、唐古特大黃不同部位組（加藥組）?？瞻捉M不加RAW264.7細(xì)胞，正常組細(xì)胞不加唐古特大黃不同部位，加藥組細(xì)胞分別加入濃度為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95 μg/mL唐古特大黃不同部位，每組5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h，在避光條件下，每孔加5 mg/mL MTT溶液20 μL，混勻后置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，加入150 μL DMSO，振蕩混勻15 min，待各孔中的紫色結(jié)晶完全溶解，于570 nm處測OD值。細(xì)胞存活率（%）=（加藥組OD值-空白組OD值）÷（正常組OD值-空白組OD值）×100%。

唐古特大黃不同部位對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響見表2。當(dāng)唐古特大黃不同部位的濃度為1000、500 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率可低于90%，各部位為其他濃度時(shí)細(xì)胞存活率均大于90%。當(dāng)唐古特大黃不同部位濃度為250 μg/mL時(shí)對細(xì)胞沒有毒性，表明濃度為250 μg/mL及以下時(shí)，給藥濃度在安全范圍內(nèi)，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 各組RAW264.7細(xì)胞在唐古特大黃不同部位作用下存活率比較（%）

2.3.3 唐古特大黃不同部位對脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌一氧化氮的影響

將RAW264.7細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、模型組及唐古特大黃不同部位組。模型組加脂多糖至終濃度150 ng/mL，唐古特大黃不同部位組加脂多糖至終濃度為150 ng/mL和唐古特大黃不同部位（A～E）至終濃度為100 μg/mL，空白組不做上述處理。每組3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。按試劑盒說明書操作，檢測細(xì)胞上清液一氧化氮（NO）含量，計(jì)算抑制率。采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。唐古特大黃不同部位對脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響見表3。

表3 各組RAW264.7細(xì)胞NO含量及抑制率比較

2.4 譜效關(guān)系

利用SIMCA13.0軟件，以唐古特大黃不同部位標(biāo)準(zhǔn)化的HPLC特征色譜峰的峰面積為自變量，抗炎率為因變量，構(gòu)建PLSR模型，進(jìn)行特征色譜峰和藥效指標(biāo)（抗炎率）回歸分析?；貧w系數(shù)和變量重要性投影（VIP）見圖3、圖4。

圖3 唐古特大黃提取物各特征峰峰面積與抗炎率的偏回歸系數(shù)

圖4 唐古特大黃提取物各特征峰峰面積與抗炎率VIP

從圖3可以看出，16、23、26、27、28、29、30號峰與抗炎率呈正相關(guān)（偏回歸系數(shù)＞0），其余色譜峰與抗炎率呈負(fù)相關(guān)（偏回歸系數(shù)＜0）。VIP用于描述自變量對因變量的解釋能力，該值越大（VIP＞1）表示解釋能力越強(qiáng)。從圖4可以看出，1、11、27、12、28、10、14、23、22、30號峰VIP＞1，表明其對抗炎活性的影響顯著。綜合分析，唐古特大黃發(fā)揮抗炎活性的主要成分可能為大黃酸（27號峰）、大黃素（28號峰）、蘆薈大黃素（23號峰）和大黃素甲醚（30號峰）。與藥效相關(guān)性最大的色譜峰均存在于二氯甲烷部位，且在該部位的分布量最多。

3 討論

炎癥是機(jī)體對致炎因子損傷作用產(chǎn)生的一種反應(yīng)，機(jī)體發(fā)生充血、腫脹、滲出、變性，局部組織缺血、缺氧伴有代謝機(jī)能改變、循環(huán)障礙等過程。其臨床表現(xiàn)多為紅腫、發(fā)熱、疼痛等。正常生理狀態(tài)下，炎癥反應(yīng)可防止機(jī)體進(jìn)一步損傷并清除已受損組織；病理狀態(tài)下，炎癥可導(dǎo)致組織破壞甚至器官功能障礙[9-10]。脂多糖是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的組成部分，可刺激巨噬細(xì)胞造成炎癥反應(yīng)。NO既是炎癥反應(yīng)與免疫調(diào)節(jié)的效應(yīng)因子，也是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，炎癥發(fā)展過程中起到非常重要作用，被廣泛應(yīng)用于藥物的抗炎作用篩選中[11-12]。

目前應(yīng)用于中藥譜效相關(guān)性分析的數(shù)據(jù)處理方法主要包括相關(guān)分析法、典型相關(guān)分析法、聚類分析法、主成分分析法、灰色關(guān)聯(lián)度分析法、回歸分析法等。各數(shù)據(jù)處理方法在具有其自身優(yōu)勢的同時(shí)均存在一定的缺陷[13]。相關(guān)分析法和灰色關(guān)聯(lián)度分析法不能解釋各色譜峰對藥效的協(xié)同作用，典型相關(guān)分析法和主成分分析法需要與其他方法聯(lián)用進(jìn)行數(shù)學(xué)模型的建立，聚類分析無法體現(xiàn)各色譜峰與藥效指標(biāo)的相關(guān)性大小和方向。偏最小二乘法集合了多元線性回歸、主成分分析和典型相關(guān)分析的優(yōu)點(diǎn)，建立數(shù)學(xué)模型的同時(shí)排除了自變量多重共線性的干擾，最大限度地利用數(shù)據(jù)信息，可較為準(zhǔn)確地解釋各色譜峰與藥效指標(biāo)的相關(guān)性大小和方向，同時(shí)能夠體現(xiàn)各色譜峰對藥效指標(biāo)的協(xié)同作用，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性和可操作性[14]。本研究采用PLSR將唐古特大黃甲醇提取物及不同極性部位萃取物HPLC指紋特征峰與其體外抗炎活性進(jìn)行譜效相關(guān)性分析，結(jié)合偏回歸系數(shù)和VIP值，考察唐古特大黃30個(gè)特征峰與抗炎活性的相關(guān)性。結(jié)果表明，1（沒食子酸）、11（番瀉苷B）、27（大黃酸）、12、28（大黃素）、10、14（番瀉苷A）、23（蘆薈大黃素）、22、30（大黃素甲醚）號色譜峰對抗炎活性的影響顯著，其中1（沒食子酸）、11（番瀉苷B）、12、10、14（番瀉苷A）、22號峰與抗炎活性呈負(fù)相關(guān)。綜合分析，唐古特大黃發(fā)揮抗炎活性的主要成分可能為大黃酸（27號峰）、大黃素（28號峰）、蘆薈大黃素（23號峰）和大黃素甲醚（30號峰）。與藥效相關(guān)性最大的色譜峰均存在于二氯甲烷部位，且在該部位的分布量最多。

本研究通過唐古特大黃甲醇提取物及不同極性部位萃取物與抗炎藥效的譜效相關(guān)性研究，初步明確唐古特大黃發(fā)揮抗炎藥效的活性部位主要為二氯甲烷部位。由于中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，以具有活性的特征成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)進(jìn)行中藥材質(zhì)量控制尤為重要。目前以化學(xué)標(biāo)志物為主的質(zhì)量控制指標(biāo)單一，與藥效關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)，無法全面反映藥材質(zhì)量與活性成分、活性成分與藥效之間的關(guān)系。課題組后續(xù)將進(jìn)行不同批次唐古特大黃抗炎活性部位的譜效關(guān)系及抗炎藥效組分配比研究，在控制唐古特大黃總蒽醌含量的基礎(chǔ)上引入質(zhì)量標(biāo)志物配比控制，進(jìn)一步完善唐古特大黃的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，也為中藥材的質(zhì)量控制研究提供新思路。