胡嬌嬌，王敏 ，錢潤 ，華中一 ，田慧 袁媛

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200； 2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京 100700；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193

天麻為蘭科植物天麻Gastrodia elataBL.的干燥塊莖，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)等功效[1]。根據(jù)天麻的形態(tài)學(xué)等特征，可分為松天麻G.elataBL. f.alba、黃天麻G.elataBL. f.flavida、烏天麻G.elataBL. f.glauca、綠天麻G.elataBL. f.viridis、紅天麻G.elataBL. f.elata共5個(gè)變種[2]。清代以前紅天麻為商品主流，《名醫(yī)別錄》記載其“生陳倉、雍州及太山、少室”[3]。受自然、社會(huì)、交通、人文和種質(zhì)資源等多種因素綜合影響，逐漸向四川、云南、貴州轉(zhuǎn)移[4-5]。云貴地區(qū)的烏天麻在清代開始興起，并逐漸成為天麻的道地藥材之一[3]。目前，紅天麻和烏天麻作為具有不同遺傳背景的優(yōu)良品系，廣泛應(yīng)用于天麻的生產(chǎn)栽培[5-8]。天麻具有鎮(zhèn)靜催眠、抗炎鎮(zhèn)痛、抗驚厥和抗氧化等活性[9-13]。然而有關(guān)紅天麻與烏天麻的藥理作用差異鮮有報(bào)道，黃穎等[14]評(píng)估了不同品系天麻凍干粉的抗驚厥及神經(jīng)保護(hù)作用，結(jié)果表明紅天麻的抗驚厥及神經(jīng)保護(hù)作用更佳。

道地藥材臨床優(yōu)效性的物質(zhì)基礎(chǔ)是其獨(dú)特的化學(xué)成分，天麻的主要活性成分和指標(biāo)性成分為酚類及其苷類[15]。除天麻素、對(duì)羥基苯甲醇和巴利森苷類成分外，天麻的其他酚酸類成分[16-17]，如香草酸、丁香酸等也具有抗腦缺血、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等多種生物活性[18-19]。本研究以不同產(chǎn)地紅天麻和烏天麻共117份樣品為研究對(duì)象，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）對(duì)烏天麻與紅天麻中19個(gè)酚酸類成分進(jìn)行定量分析，探究其含量差異，在此基礎(chǔ)上，使用熱板致痛和醋酸致痛2種模型評(píng)估紅天麻、烏天麻及含量差異成分的鎮(zhèn)痛作用，以明確紅天麻與烏天麻的功效差異及其物質(zhì)基礎(chǔ)，為天麻道地藥材開發(fā)及臨床應(yīng)用提供參考。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng)（包括二元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱），美國Waters公司；QTRAP 6500三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX公司，配有離子噴霧接口；SB-800DTD型超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；MS-S十萬分之一電子天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司；MM 400混合型球磨儀，Retsch公司；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Pacific T-Ⅱ型超純水儀，美國Thermo公司；Centrifuge 5415D型離心機(jī)，德國Eppendorf公司；DHG-9145AZ電熱干燥箱，上海恒科儀器有限公司；RB-200智能熱板儀，成都泰盟軟件有限公司。

醋酸潑尼松片（批號(hào)160337，浙江仙琚制藥有限公司）；對(duì)羥基苯甲醛（批號(hào)D-058-181216，含量≥99%）、原兒茶醛（批號(hào)Y-O32-180426，含量≥99%）、對(duì)羥基苯甲酸（批號(hào)R-D063-181216，含量≥98%）、丁香酸（批號(hào)D-019-180426）、巴利森苷E（批號(hào)B-050-151017，含量≥98%）、巴利森苷C（批號(hào)B-049-181028，含量≥98%）、對(duì)羥基苯甲醇（批號(hào)D-105-180905，含量≥98%）、L-焦谷氨酸（批號(hào)B25551-200，含量≥99%）、香草醛（批號(hào)X-012-171216，含量≥99%）、原兒茶酸（批號(hào)R-Y568-181216，含量≥99%）、香草酸（批號(hào)X-030-180322，含量≥99%）、巴利森苷B（批號(hào)B-048-181022，含量≥99%）、巴利森苷A（批號(hào)B-047-181015，含量≥99%）、煙酸（批號(hào)Y-062-180426，含量≥99%），北京融成鑫德科技發(fā)展有限公司；天麻素（批號(hào)110807-201507，含量以96.7%計(jì)）、腺苷（批號(hào)110879-200202，含量＞99.0%）、苯甲酸（批號(hào)100419-201703，含量≥99%）、琥珀酸（批號(hào)110896-201602，含量≥99%）、肉桂酸（批號(hào)110786-201604，含量≥99%），中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純，美國Merk公司。0.22 μm PTFE濾膜，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。Milli-Q超純水，其余試劑為分析純。

117份樣品采集于4個(gè)天麻主產(chǎn)區(qū)，其中紅天麻來自陜西省安康市寧陜縣25份、湖北省黃岡市英山縣20份，烏天麻來自貴州省畢節(jié)市大方縣30份、云南省昭通市彝良縣42份，由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心金艷副研究員鑒定，樣本保存于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心?；谡n題組前期建立的紅天麻、烏天麻特異性PCR鑒別方法[20]，確認(rèn)上述樣品分別為紅天麻GastrodiaelataBL. f.elata和烏天麻G.elataBL. f.glauca的干燥塊莖。

SPF級(jí)ICR雄性小鼠，體質(zhì)量16～18 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006，使用許可證號(hào)SYXK（京）2016-0006。SPF級(jí)ICR雌性小鼠，體質(zhì)量17～19 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2017-0020，使用許可證號(hào)SYXK（京）2021-0006。均飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，溫度20～26 ℃，濕度40%～70%。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC-MS/MS檢測(cè)

色譜條件：采用ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美國Waters公司），流動(dòng)相為0.1%甲酸-乙腈（A）和0.1%甲酸-水溶液（B），梯度洗脫（0 min，1%A；0～2 min，1%～5%A；2～5 min，5%～15%A；5～7 min，15%～30%A；7～7.1 min，30%～95%A；7.1～9 min，95%A；9～9.1 min，95%～5%A；9.1～12 min，5%A），流速0.5 mL/min，柱溫40 ℃，樣品室溫度20 ℃，進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI），采用負(fù)離子檢測(cè)模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）進(jìn)行定量分析，離子化溫度550 ℃。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 對(duì)照品溶液

精密稱取對(duì)羥基苯甲醛、原兒茶醛、對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸、巴利森苷E、巴利森苷C、腺苷、對(duì)羥基苯甲醇、L-焦谷氨酸、原兒茶酸、香草酸、天麻素、巴利森苷B、巴利森苷A、煙酸、香草醛、苯甲酸、肉桂酸、琥珀酸對(duì)照品，加50%甲醇水分別制成濃度為2.0 g/L的對(duì)照品母液，再制備成終濃度為0.1 g/L的混合對(duì)照品溶液；巴利森苷E、巴利森苷C、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷B、巴利森苷A、天麻素再制備成終濃度為0.5 g/L的混合對(duì)照品溶液，置于4 ℃冰箱備用。

2.1.2.2 供試品溶液

3 母乳喂養(yǎng)的寶寶滿月至4個(gè)月的時(shí)候會(huì)聚肚，每個(gè)寶寶聚肚的時(shí)間不一定，聚肚后大便會(huì)規(guī)律的每日一次，但聚肚前會(huì)有幾天不大便。

精密稱取紅天麻和烏天麻藥材粉末0.05 g（過50目篩），加入50%甲醇水溶液1 mL，稱定質(zhì)量，室溫超聲提?。üβ?20 W，頻率40 kHz）30 min，再次稱定，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，重復(fù)提取1次，提取液13000 r/min離心10 min，取2次上清液，合并，0.22 μm濾膜過濾，備用。

2.1.3 紅天麻與烏天麻差異成分篩選

參考文獻(xiàn)[21-22]方法，采用UPLC-MS/MS對(duì)紅天麻和烏天麻中19種酚酸類成分進(jìn)行定量分析，結(jié)果見表1。結(jié)合P值（P＜0.05）和各成分相對(duì)含量發(fā)現(xiàn)，紅天麻與烏天麻中天麻素、丁香酸、琥珀酸、L-焦谷氨酸含量存在差異。

表1 紅天麻與烏天麻中19個(gè)酚酸類成分含量測(cè)定結(jié)果（±sx，%，n≥45）

表1 紅天麻與烏天麻中19個(gè)酚酸類成分含量測(cè)定結(jié)果（±sx，%，n≥45）

注：與烏天麻比較，*P＜0.05，**P＜0.01

烏天麻0.28335±0.02380 0.04830±0.01067 0.23577±0.02782 0.00867±0.00159 0.11813±0.02097 0.11846±0.02112 0.00052±0.00010 0.00464±0.00032 0.00327±0.00025 0.00009±0.00001 0.00274±0.00045 0.00163±0.00022 0.00038±0.00003 0.00236±0.00022 0.00013±0.00001 0.00019±0.00003 0.00020±0.00002 0.00072±0.00011 0.01156±0.00100成分對(duì)羥基苯甲醇天麻素巴利森苷E巴利森苷C巴利森苷B巴利森苷A苯甲酸琥珀酸對(duì)羥基苯甲醛煙酸L-焦谷氨酸原兒茶醛對(duì)羥基苯甲酸肉桂酸香草醛原兒茶酸香草酸丁香酸腺苷紅天麻0.20839±0.01640*0.10126±0.02364*0.31554±0.03220*0.01135±0.00230*0.15368±0.03081*0.15082±0.03207*0.00080±0.00013*0.00667±0.00073**0.00333±0.00035 0.00002±0.00000**0.00332±0.00056 0.00144±0.00027 0.00035±0.00003 0.00331±0.00028**0.00016±0.00002 0.00022±0.00004 0.00017±0.00002 0.00253±0.00030**0.01297±0.00066

2.2 鎮(zhèn)痛藥效評(píng)價(jià)

2.2.1 藥液制備

取紅天麻、烏天麻藥材粉碎，過80目篩，再用120目篩過篩，得80～120目普通粉[23]。分別稱取紅天麻、烏天麻適量，加超純水制成濃度為2 g/mL的母液，稀釋成梯度濃度（1、0.5、0.25 g/mL）的溶液。

分別稱取天麻素、丁香酸、琥珀酸、L-焦谷氨酸、醋酸潑尼松適量，加超純水制成濃度依次為0.04、0.04、0.236、0.3、2 mg/mL的藥液。

2.2.2 紅天麻與烏天麻鎮(zhèn)痛作用比較

2.2.2.1 熱板法

參考文獻(xiàn)[24]選用ICR雌性小鼠，先將熱板預(yù)熱至55 ℃左右，觀察并記錄小鼠從被放置于熱板上至舔后足的反應(yīng)時(shí)間（s），為痛閾值。篩選痛閾值合格（5～30 s）的小鼠72只，隨機(jī)分為8組，分別為空白對(duì)照組，陽性對(duì)照組（醋酸潑尼松片20 mg/kg），烏天麻高、中、低劑量組（10、5、2.5 g/kg），紅天麻高、中、低劑量組（10、5、2.5 g/kg），每組9只。給藥組分別灌胃相應(yīng)藥液，灌胃體積為10 mL/kg，空白對(duì)照組灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)14 d。末次給藥后測(cè)定各組小鼠痛閾值。參考2020年版《中華人民共和國藥典》天麻的用法用量[1]及前期鎮(zhèn)痛研究[23，25]設(shè)置給藥劑量。

與空白對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組能顯著提高熱板致痛的小鼠痛閾值（P＜0.05），紅天麻高劑量組作用與陽性對(duì)照組相似（P＜0.05），而烏天麻對(duì)小鼠痛閾值無明顯影響，見表2。

表2 紅天麻與烏天麻對(duì)小鼠熱板法痛閾值影響比較（±sx，s）

表2 紅天麻與烏天麻對(duì)小鼠熱板法痛閾值影響比較（±sx，s）

注：不同字母表示組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05

痛閾值13.44±1.39b 20.33±2.33a 13.03±1.20b 11.42±0.89b 13.37±0.91b 14.79±0.41b 14.83±0.39b 19.45±2.67a組別空白對(duì)照組陽性對(duì)照組烏天麻低劑量組烏天麻中劑量組烏天麻高劑量組紅天麻低劑量組紅天麻中劑量組紅天麻高劑量組劑量只數(shù)20 mg/kg 2.5 g/kg 5.0 g/kg 10.0 g/kg 2.5 g/kg 5.0 g/kg 10.0 g/kg 99999999

2.2.2.2 醋酸扭體法

選取ICR雌性小鼠和雄性小鼠各72只，分別隨機(jī)分為8組，即空白對(duì)照組，陽性對(duì)照組（醋酸潑尼松片20 mg/kg），烏天麻高、中、低劑量組（10、5、2.5 g/kg），紅天麻高、中、低劑量組（10、5、2.5 g/kg），每組9只。各給藥組分別灌胃相應(yīng)藥液，灌胃體積均為10 mL/kg，空白對(duì)照組灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)14 d。末次給藥30 min后，小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸0.1 mL/10 g，觀察并記錄注射后15 min內(nèi)小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)[24]。

紅天麻和烏天麻均有減少雄性小鼠醋酸扭體反應(yīng)次數(shù)的趨勢(shì)。與空白對(duì)照組比較，烏天麻中劑量組、烏天麻高劑量組、紅天麻中劑量組、紅天麻高劑量組均可顯著減少醋酸致痛后15 min內(nèi)雄性小鼠扭體次數(shù)（P＜0.05）。與空白對(duì)照組比較，紅天麻高劑量組可顯著減少醋酸致痛后15 min內(nèi)雌性小鼠扭體次數(shù)（P＜0.05），烏天麻組對(duì)于減少雌性小鼠醋酸扭體反應(yīng)無顯著作用（P＞0.05）。見表3。

表3 紅天麻與烏天麻對(duì)雄性和雌性小鼠扭體次數(shù)影響比較（±sx）

表3 紅天麻與烏天麻對(duì)雄性和雌性小鼠扭體次數(shù)影響比較（±sx）

注：不同字母表示組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05

雌性25.56±2.27ab 18.00±2.05c 20.56±2.89bc 21.89±2.13bc 25.56±2.79ab 24.22±3.00abc 29.44±2.97a 18.11±2.79c組別空白對(duì)照組陽性對(duì)照組烏天麻低劑量組烏天麻中劑量組烏天麻高劑量組紅天麻低劑量組紅天麻中劑量組紅天麻高劑量組劑量只數(shù)20 mg/kg 2.5 g/kg 5.0 g/kg 10.0 g/kg 2.5 g/kg 5.0 g/kg 10.0 g/kg 99999999雄性27.78±2.84a 11.00±1.65c 21.33±2.70b 10.44±1.64c 12.89±1.48c 14.22±2.37c 13.00±1.46c 12.56±2.24c

2.2.3 紅天麻與烏天麻差異成分的鎮(zhèn)痛作用

2.2.3.1 熱板法

按“2.2.2.1”項(xiàng)下方法，選取ICR雌性小鼠81只，隨機(jī)分為9組，分別為空白對(duì)照組，丁香酸高、低劑量組（400、200 mg/kg），琥珀酸高、低劑量組（236、118 mg/kg），天麻素高、低劑量組（400、200 mg/kg），L-焦谷氨酸高、低劑量組（100、50 mg/kg），每組9只，給藥組分別灌胃相應(yīng)藥液，灌胃體積10 mL/kg，每日1次，連續(xù)5 d。末次給藥后測(cè)定各組小鼠痛閾值。

與空白對(duì)照組比較，天麻素高劑量組、琥珀酸低劑量組、琥珀酸高劑量組、L-焦谷氨酸低劑量組和L-焦谷氨酸高劑量組均能顯著提高小鼠熱板致痛的痛閾值（P＜0.05），琥珀酸組、L-焦谷氨酸組存在一定劑量依賴性，其他組無顯著作用（P＞0.05）。見表4。

表4 紅天麻與烏天麻差異成分對(duì)小鼠熱板法痛閾值影響比較（±sx，s）

表4 紅天麻與烏天麻差異成分對(duì)小鼠熱板法痛閾值影響比較（±sx，s）

注：不同字母表示組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05

組別空白對(duì)照組丁香酸低劑量組丁香酸高劑量組天麻素低劑量組天麻素高劑量組琥珀酸低劑量組琥珀酸高劑量組L-焦谷氨酸低劑量組L-焦谷氨酸高劑量組痛閾值13.54±0.73d 15.13±0.63cd 17.20±1.57bcd 15.72±1.13cd 17.66±0.90bc 16.44±0.70cd 22.01±2.57a 15.10±0.80cd 21.07±2.24ab劑量/（mg/kg）只數(shù)200400 200400 118236 50100 999999999

2.2.3.2 醋酸扭體法

選取ICR雄性小鼠81只，隨機(jī)分為9組，分別為空白對(duì)照組，丁香酸高、低劑量組（400、200 mg/kg），琥珀酸高、低劑量組（236、118 mg/kg），天麻素高、低劑量組（400、200 mg/kg），L-焦谷氨酸高、低劑量組（100、50 mg/kg），給藥組分別灌胃相應(yīng)藥液，灌胃體積10 mL/kg，每日1次，連續(xù)5 d。末次給藥30 min后，小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸0.1 mL/10 g，觀察并記錄注射后15 min內(nèi)小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)。

與空白對(duì)照組比較，丁香酸低劑量組、丁香酸高劑量組、天麻素低劑量組、天麻素高劑量組、琥珀酸低劑量組、琥珀酸高劑量組、L-焦谷氨酸低劑量組、L-焦谷氨酸高劑量組均可顯著減少醋酸致痛后15 min內(nèi)小鼠的扭體次數(shù)（P＜0.01），其中琥珀酸、L-焦谷氨酸減少小鼠扭體次數(shù)效果更好。見表5。

表5 紅天麻與烏天麻差異成分對(duì)小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)影響比較（±sx）

表5 紅天麻與烏天麻差異成分對(duì)小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)影響比較（±sx）

注：不同字母表示組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01

組別空白對(duì)照組丁香酸低劑量組丁香酸高劑量組天麻素低劑量組天麻素高劑量組琥珀酸低劑量組琥珀酸高劑量組L-焦谷氨酸低劑量組L-焦谷氨酸高劑量組扭體次數(shù)25.11±2.63a 15.78±1.13b 13.00±1.31bc 13.00±1.89bc 13.33±0.91bc 10.89±1.29bc 10.00±1.76bc 7.56±4.38c 8.44±1.14c劑量/（mg/kg）只數(shù)200400 200400 118236 50100 999999999

3 討論

天麻始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，紅天麻、烏天麻是目前栽培生產(chǎn)的主要品系[3，5，26]。《本草綱目》記載天麻為治風(fēng)神藥[27]，用于肝虛頭痛、風(fēng)濕痹痛等[9]。天麻酚類成分具較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用[28-29]，但有關(guān)天麻不同品系及其酚類差異成分對(duì)鎮(zhèn)痛藥效的影響鮮見報(bào)道。本研究測(cè)定天麻19個(gè)酚酸類成分含量，發(fā)現(xiàn)天麻素、琥珀酸、L-焦谷氨酸、丁香酸4種化合物在紅天麻與烏天麻中存在含量差異。其中天麻素為天麻的主要活性成分之一，其鎮(zhèn)痛作用較為顯著[30-31]。

本研究利用熱板致痛法和醋酸扭體法對(duì)烏天麻、紅天麻及其差異成分的鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行比較。其中熱板致痛法為物理性鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)方法，以熱刺激開始至小鼠出現(xiàn)舔后足反應(yīng)的潛伏期反應(yīng)時(shí)間作為測(cè)痛指標(biāo)[32]。醋酸扭體法為化學(xué)刺激法，通過給予小鼠腹腔內(nèi)注入化學(xué)物質(zhì)，引起腹部深部的扭體反應(yīng)疼痛刺激來評(píng)價(jià)藥物的鎮(zhèn)痛作用[33]。熱板致痛法一般用于評(píng)價(jià)中樞參與的鎮(zhèn)痛作用，而醋酸扭體法用于外周鎮(zhèn)痛藥物的篩選[34]。在不同鎮(zhèn)痛模型中，紅天麻和烏天麻及其酚酸類差異成分的鎮(zhèn)痛效果存在明顯差異，其中紅天麻對(duì)外周性疼痛和中樞性疼痛均有一定的鎮(zhèn)痛作用，但對(duì)中樞性疼痛鎮(zhèn)痛效果更好，而烏天麻僅對(duì)中樞性疼痛有鎮(zhèn)痛效果；紅天麻與烏天麻4種差異成分天麻素、丁香酸、琥珀酸、L-焦谷氨酸均具有中樞性鎮(zhèn)痛作用，且琥珀酸、L-焦谷氨酸的中樞性鎮(zhèn)痛作用更為顯著。上述結(jié)果與天麻臨床多用于治療偏頭痛[35-36]一致，可為進(jìn)一步探究紅天麻和烏天麻在鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥、抗眩暈等中樞神經(jīng)性疾病是否存在差異及作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。