唐雅妮，肖豆 ，馬文娟 ，謝崢嶸 ，潘江 ，婁必丹 ，章薇 ，陳成

1.長(zhǎng)沙民政職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；3.同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院，上海 200090；4.長(zhǎng)沙市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410100

急性腦缺血是由不同原因?qū)е麓竽X供血?jiǎng)用}狹窄或閉塞而出現(xiàn)腦部供血障礙，繼而引起神經(jīng)功能障礙或腦組織缺血性壞死，是腦卒中最常見(jiàn)的類型，約75%的患者會(huì)發(fā)生與神經(jīng)相關(guān)的功能障礙[1-2]。腦缺血后功能的恢復(fù)與神經(jīng)修復(fù)和再生有關(guān)[3]，缺血損傷后神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子表達(dá)升高是導(dǎo)致神經(jīng)再生障礙的關(guān)鍵原因[4]。研究發(fā)現(xiàn)，Ras同源基因家族成員A（RhoA）及其下游效應(yīng)因子Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK）Ⅱ參與神經(jīng)軸突出芽、生長(zhǎng)等生理過(guò)程，RhoA/ROCK通路可以調(diào)控神經(jīng)軸突損傷后的再生[5]。針灸作為補(bǔ)充和替代療法，能有效治療缺血性腦卒中[6-8]，改善神經(jīng)功能缺損及相關(guān)功能障礙[9]，通過(guò)調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是神經(jīng)再生、修復(fù)和改善神經(jīng)元突觸功能，對(duì)腦缺血損傷產(chǎn)生有益影響[10-12]。本研究在前期研究[13-16]基礎(chǔ)上，從RhoA、ROCKⅡ角度探討電針心包經(jīng)穴對(duì)急性腦缺血大鼠的神經(jīng)修復(fù)作用及機(jī)制，為臨床從心治腦提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與相關(guān)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)成年雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量（235±15）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度55%～70%環(huán)境，自然光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，造模前禁食24 h。

1.2 主要試劑與儀器

大鼠RhoA ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)，貨號(hào)ml038156），ROCKⅡ ELISA試劑盒（武漢華美，貨號(hào)CSB-EL020059RA），二步法試劑盒（北京中杉金橋，貨號(hào)PV-9003），DBA試劑盒（北京中杉金橋，貨號(hào)ZLI-9018），β-actin抗體（美國(guó)Proteintech，貨號(hào)66009-1-Ig），RhoA抗體（美國(guó)Proteintech，貨號(hào)10749-1-AP），ROCKⅡ抗體（美國(guó)Proteintech，貨號(hào)21645-1-AP），HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗（美國(guó)Proteintech，貨號(hào)SA00001-1），HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（美國(guó)Proteintech，貨號(hào)SA00001-2），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國(guó)北京康為世紀(jì)，貨號(hào)CW2569），Trizol（美國(guó)Thermo，貨號(hào)15596026）。0.30 mm×15 mm一次性華佗牌毫針、SDZ-Ⅱ型華佗電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；H1650R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀）；PW-812型全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（深圳匯松）；MB-530型多功能酶標(biāo)分析儀（深圳匯松）；PIKO REAL 96型熒光定量RCP儀（美國(guó)Thermo）；SPL0960型熒光PCR板（美國(guó)Thermo）；DYY-6C型電泳儀（北京六一）；DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一）。

1.3 分組與造模

采用隨機(jī)數(shù)字表法將90只大鼠隨機(jī)分為空白組18只、假手術(shù)組18只、造模組54只。造模成功后，將造模組隨機(jī)分為模型組、心包經(jīng)組和肺經(jīng)組，每組18只。各組再隨機(jī)分配至干預(yù)7、14、21d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只。

根據(jù)Zea Longa方法[17]，并結(jié)合前期研究[13-16]，采用頸外動(dòng)脈插入線栓法建立大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型?？瞻捉M僅捆綁處理，假手術(shù)組只分離血管不插入栓線。造模完成后24 h采用Zea Longa 5級(jí)4分制評(píng)分法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，選取評(píng)分為1～3分大鼠納入實(shí)驗(yàn)。

1.4 干預(yù)

根據(jù)手三陰經(jīng)“從胸走手”循行方向，選取大鼠癱瘓側(cè)肢體不同神經(jīng)節(jié)段的常用腧穴代表心包經(jīng)和肺經(jīng)。以“天泉”“曲澤”“內(nèi)關(guān)”“大陵”代表心包經(jīng)、“天府”“尺澤”“列缺”“太淵”代表肺經(jīng)，腧穴定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[18]。造模成功后次日開(kāi)始針刺，毫針刺入大鼠上肢癱瘓側(cè)穴位，針刺深度3～4 mm，接電針治療儀。心包經(jīng)組以“天泉”“曲澤”為一組，“內(nèi)關(guān)”“大陵”為一組；肺經(jīng)組以“天府”“尺澤”為一組，“列缺”“太淵”為一組。正極接近心端腧穴，負(fù)極接遠(yuǎn)心端腧穴，選用連續(xù)波，頻率20 Hz，輸出電壓2～4 V，電流強(qiáng)度4～6 mA，以大鼠上肢輕顫為度，刺激時(shí)間30 min/次，連續(xù)干預(yù)6 d，間隔1 d，共21 d。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 HE染色

干預(yù)結(jié)束后，大鼠用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，斷頭，取梗死區(qū)腦組織，用乙醇和二甲苯脫水，石蠟包埋并切片，烤片脫蠟，水化后用蘇木精-伊紅染色，樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.5.2 ELISA檢測(cè)

大鼠麻醉處死后，取腹主動(dòng)脈血4～5 mL，4 ℃、3000 r/min離心15 min，分離血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清RhoA、ROCKⅡ含量。

1.5.3 免疫組化染色

按照免疫組化試劑盒說(shuō)明操作，標(biāo)本采集后常規(guī)制作石蠟切片，抗原熱修復(fù)后滴加RhoA、ROCKⅡ一抗（1∶200），4 ℃孵育過(guò)夜，滴加二抗（1∶200），37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，各級(jí)乙醇脫水，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察梗死區(qū)腦組織陽(yáng)性表達(dá)（黃色、棕黃色或褐色染色），每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)不重疊視野，采集圖像后用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)定陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度。

1.5.4 RT-PCR檢測(cè)

取梗死區(qū)腦組織，提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增，運(yùn)用primer5軟件設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1）。以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因PCR引物序列

1.5.5 Western blot檢測(cè)

取梗死區(qū)腦組織，每100 mg組織加入RIPA裂解液1 mL，吸取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入上樣緩沖液加熱、變性后，進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移至NC膜，5%脫脂奶粉室溫密封60 min，加入RhoA一抗（1∶1000）、ROCKⅡ一抗（1∶3000）、β-actin一抗（1∶5000），4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜，與HRP標(biāo)記二抗室溫孵育90 min。用ECL化學(xué)發(fā)光液曝光后顯影。采用Quantity One軟件分析條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布用方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用Tambane's T2 或Games-Howell法；不符合正態(tài)分布用多個(gè)獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)模型大鼠梗死區(qū)腦組織病理形態(tài)的影響

空白組、假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞胞漿豐富，核仁清晰；模型組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞核固縮，間質(zhì)染色稀疏；與模型組比較，心包經(jīng)組和肺經(jīng)組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)有所改善，核固縮程度減輕，神經(jīng)元數(shù)量增加，心包經(jīng)組改善更為明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠梗死區(qū)腦組織形態(tài)（HE染色，×400）

2.2 電針對(duì)模型大鼠血清RhoA、ROCKⅡ含量的影響

與空白組、假手術(shù)組同一時(shí)點(diǎn)比較，模型組大鼠各時(shí)點(diǎn)血清RhoA、ROCKⅡ含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組同一時(shí)點(diǎn)比較，心包經(jīng)組大鼠各時(shí)點(diǎn)血清RhoA含量明顯減少（P＜0.05），14、21 d血清ROCKⅡ含量明顯減少（P＜0.01）；與肺經(jīng)組同一時(shí)點(diǎn)比較，心包經(jīng)組大鼠7、14 d血清RhoA含量明顯減少（P＜0.01），14、21 d血清ROCKⅡ含量明顯減少（P＜0.01，P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠血清RhoA、ROCKⅡ含量比較（±s，每組6只）

2.3 電針對(duì)模型大鼠梗死區(qū)腦組織RhoA和ROCKⅡ表達(dá)的影響

與空白組、假手術(shù)組同一時(shí)點(diǎn)比較，模型組大鼠各時(shí)點(diǎn)梗死區(qū)腦組織RhoA、ROCKⅡ表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組同一時(shí)點(diǎn)比較，心包經(jīng)組大鼠各時(shí)點(diǎn)梗死區(qū)腦組織RhoA、ROCKⅡ表達(dá)明顯降低（P＜0.01），肺經(jīng)組大鼠14、21 d梗死區(qū)腦組織RhoA、ROCKⅡ表達(dá)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；與肺經(jīng)組同一時(shí)點(diǎn)比較，心包經(jīng)組大鼠14、21 d梗死區(qū)腦組織RhoA表達(dá)明顯降低（P＜0.05），各時(shí)點(diǎn)ROCKⅡ表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖3～圖5。

圖3 各組大鼠梗死區(qū)腦組織RhoA陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖4 各組大鼠梗死區(qū)腦組織ROCKⅡ陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖5 各組大鼠梗死區(qū)腦組織RhoA、ROCKⅡ表達(dá)比較（±s，每組6只）

2.4 電針對(duì)模型大鼠梗死區(qū)腦組織RhoA、ROCKⅡmRNA表達(dá)的影響

與空白組、假手術(shù)組同一時(shí)點(diǎn)比較，模型組大鼠各時(shí)點(diǎn)梗死區(qū)腦組織RhoA、ROCKⅡ mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組同一時(shí)點(diǎn)比較，心包經(jīng)組大鼠各時(shí)點(diǎn)梗死區(qū)腦組織RhoA、ROCKⅡ mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）；與肺經(jīng)組同一時(shí)點(diǎn)比較，心包經(jīng)組大鼠21 d梗死區(qū)腦組織RhoA、ROCKⅡ mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖6。

圖6 各組大鼠梗死區(qū)腦組織RhoA、ROCKⅡ mRNA表達(dá)比較（±s，每組6只）

2.5 電針對(duì)模型大鼠梗死區(qū)腦組織RhoA、ROCKⅡ蛋白表達(dá)的影響

與空白組、假手術(shù)組同一時(shí)點(diǎn)比較，模型組大鼠各時(shí)點(diǎn)腦組織梗死區(qū)RhoA、ROCKⅡ蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組同一時(shí)點(diǎn)比較，心包經(jīng)組大鼠各時(shí)點(diǎn)腦組織梗死區(qū)RhoA、ROCKⅡ蛋白的表達(dá)均降低（P＜0.05，P＜0.01），肺經(jīng)組7、14 d RhoA蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），21 d ROCKⅡ蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與肺經(jīng)組同一時(shí)點(diǎn)比較，心包經(jīng)組大鼠各時(shí)點(diǎn)梗死區(qū)腦組織RhoA、ROCKⅡ蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖7、圖8。

圖7 各組大鼠梗死區(qū)腦組織RhoA、ROCKⅡ蛋白免疫印跡

圖8 各組大鼠腦組織梗死區(qū)RhoA、ROCKⅡ蛋白表達(dá)比較（±s，每組6只）

3 討論

腦缺血的繼發(fā)性損害因素有多種，大腦一旦發(fā)生梗死，由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)與再生能力有限，神經(jīng)損傷后很難完全恢復(fù)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)受神經(jīng)因子促進(jìn)因素與神經(jīng)軸突生長(zhǎng)抑制因素的雙重調(diào)節(jié)，因此有效抑制神經(jīng)軸突生長(zhǎng)抑制因子的表達(dá)是促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的重要途徑，對(duì)腦卒中神經(jīng)軸突重建和恢復(fù)具有重要意義[19]。研究表明，電針“神庭”“百會(huì)”能降低海馬組織RhoA蛋白表達(dá)，改善MCAO大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[20]。作為治療缺血性腦卒中的靶點(diǎn)，ROCK抑制劑已被證實(shí)通過(guò)改變炎癥、血小板、內(nèi)皮功能、平滑肌收縮和神經(jīng)元再生，在神經(jīng)保護(hù)、腦卒中預(yù)防和恢復(fù)方面發(fā)揮有益作用[21]。ROCKⅠ主要在非神經(jīng)元組織中表達(dá)，ROCKⅡ主要在腦和脊髓中表達(dá)。故本實(shí)驗(yàn)以RhoA、ROCKⅡ?yàn)榍腥朦c(diǎn)，研究電針心包經(jīng)穴對(duì)急性腦缺血大鼠神經(jīng)軸突生長(zhǎng)抑制因子的影響。

RhoA/ROCK信號(hào)通路激活會(huì)抑制神經(jīng)軸突生長(zhǎng)，因此，下調(diào)NogoA/RhoA/ROCK通路可消除抑制急性腦缺血后神經(jīng)再生的障礙[22]。Nogo-A與其受體蛋白NgR結(jié)合后，啟動(dòng)下游RhoA/ROCK信號(hào)通路，從而抑制軸突生長(zhǎng)，阻礙神經(jīng)修復(fù)和再生[23]。RhoA是小G蛋白超家族中Rho家族亞族的成員，ROCK是Rho GTP酶的下游效應(yīng)分子。RhoA通過(guò)激活肌動(dòng)蛋白抑制軸突生長(zhǎng)，因此，神經(jīng)元中RhoA缺失時(shí)會(huì)刺激神經(jīng)軸突再生反應(yīng)[24]。神經(jīng)樹(shù)突、軸突的生長(zhǎng)和軸突的導(dǎo)向都離不開(kāi)RhoA磷酸化，磷酸化后的RhoA被激活，腦缺血可使失活的RhoA蛋白被激活，進(jìn)而刺激下游效應(yīng)分子ROCK，變?yōu)榛罨癄顟B(tài)的ROCK與GTP結(jié)合體，活化狀態(tài)的ROCK將激活ROCK底物[25]。Yamashita等[26]發(fā)現(xiàn)，在急性腦缺血大鼠中神經(jīng)元軸突ROCKⅡ表達(dá)和活性均增加，說(shuō)明ROCKⅡ在缺血性神經(jīng)元損傷中起關(guān)鍵作用。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠各時(shí)點(diǎn)梗死區(qū)腦組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)紊亂，且血清RhoA、ROCKⅡ含量及梗死區(qū)腦組織mRNA和蛋白表達(dá)均高于空白組和假手術(shù)組，提示急性腦缺血后導(dǎo)致大鼠神經(jīng)軸突生長(zhǎng)抑制因子增加，可能與RhoA/ROCK通路激活有關(guān)。心包經(jīng)組大鼠梗死區(qū)腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)改善，且血清RhoA、ROCKⅡ含量及梗死區(qū)腦組織mRNA和蛋白表達(dá)均低于模型組，提示電針心包經(jīng)穴能改善細(xì)胞形態(tài)，下調(diào)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)抑制因子表達(dá)，其機(jī)制可能與抑制RhoA/ROCK通路激活有關(guān)。且電針心包經(jīng)穴下調(diào)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)抑制因子表達(dá)效果優(yōu)于電針?lè)谓?jīng)穴，可能與經(jīng)脈具有特異性有關(guān)。謝崢嶸等[27-28]研究電針手厥陰心包經(jīng)穴對(duì)MCAO大鼠不同時(shí)點(diǎn)腦組織SYP、PSD-95及神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子表達(dá)的影響也證實(shí)了腦缺血后電針心包經(jīng)穴優(yōu)于肺經(jīng)穴。

綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，電針心包經(jīng)穴能下調(diào)急性腦缺血大鼠血清RhoA、ROCKⅡ含量及梗死區(qū)腦組織RhoA、ROCKⅡ表達(dá)，其機(jī)制可能與抑制RhoA/ROCK通路激活相關(guān)。