尹倩，周德生 ，陳瑤 ，申毅 張宇星 ，曾富康 ，蘇曉舟 ，劉利娟

1.邵東市人民醫(yī)院，湖南 邵東 422800； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007

腦梗死又稱缺血性卒中，是卒中的常見(jiàn)類型，約占全部卒中的69.6%，是卒中患者死亡的主要原因[1]。使用重組組織型纖溶酶原激活劑（rt-PA）溶栓是當(dāng)前首選治療方案[2]。使用rt-PA的時(shí)間應(yīng)在3 h內(nèi)，最遲不超過(guò)4.5 h，使用尿激酶溶栓的時(shí)間窗可適當(dāng)放寬至6 h內(nèi)。然而由于嚴(yán)格的時(shí)間窗限制，使獲得溶栓治療的急性腦梗死患者比例極低。外科機(jī)械取栓也有時(shí)間窗限制，前循環(huán)大血管閉塞的取栓時(shí)間為6 h，后循環(huán)動(dòng)脈閉塞時(shí)間窗可延至24 h[3]。盡管藥物溶栓或機(jī)械取栓恢復(fù)部分或全部血流灌注，一定程度上可恢復(fù)組織功能，但是可能出現(xiàn)腦組織損傷加重、功能進(jìn)一步惡化等病理生理過(guò)程，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）[4-5]。因此，考慮到目前急性腦梗死發(fā)病特點(diǎn)及治療手段限制，理想的治療方案是在恢復(fù)缺血組織血氧供應(yīng)同時(shí)盡可能避免或減輕再灌注所致二次損傷。

CIRI形成涉及一系列病理過(guò)程，如氧化應(yīng)激障礙、細(xì)胞凋亡、線粒體自噬、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞焦亡等[6-10]，其中炎癥反應(yīng)在CIRI中扮演重要角色[11-12]。NLRP3炎癥小體由NLRP3蛋白、胱天蛋白酶-1（Caspase-1）和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）構(gòu)成，其激活后會(huì)誘導(dǎo)腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞合成炎癥因子，并加速釋放，誘發(fā)中樞系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，加重CIRI。

腦梗死屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇。榮氣為氣血陰陽(yáng)津液的綜合功能[13]，既具精微物質(zhì)屬性，又兼氣化運(yùn)動(dòng)功能，精微耗損易致榮氣虛，氣化失司、運(yùn)動(dòng)失常易發(fā)榮氣滯，而榮氣虛滯互為因果，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)邪交互、神機(jī)失用，發(fā)為此病[14-15]。活血榮絡(luò)方是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，基于榮氣虛滯理論創(chuàng)制，臨床療效顯著、安全性好。課題組前期研究顯示，活血榮絡(luò)方能通過(guò)激活自噬減輕CIRI炎癥過(guò)程和氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎癥因子分泌，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[16-18]。本實(shí)驗(yàn)以NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡為切入點(diǎn)，深入研究活血榮絡(luò)方對(duì)CIRI的保護(hù)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

72只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（260±20）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)SYXK（湘）2020-0010，溫度（24±2）℃，濕度60%±10%，12 h明暗交替。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（20201010-13）。

1.2 藥物及制備

活血榮絡(luò)方由雞血藤、石楠藤、生地黃、黃精、玄參、川芎、乳香、沒(méi)藥按6∶6∶3∶3∶2∶2∶2∶2比例組成，飲片購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，常規(guī)煎煮，水浴濃縮成原藥材濃度為2.34 g/mL藥液。灌胃前取適量藥液，用蒸餾水分別稀釋成0.585、1.17 g/mL。尼莫地平片，正大青春寶藥業(yè)有限公司，20 mg/片，批號(hào)1912012，用蒸餾水配制成濃度為1.1 mg/mL藥液。

1.3 主要試劑與儀器

水合氯醛（麥克林，貨號(hào)C804539），TTC粉末（Sigma公司，貨號(hào)T8877-10G），BCA蛋白定量試劑盒（聯(lián)科生物，貨號(hào)70-PQ0012），大鼠白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-18 ELISA試劑盒（伊萊瑞特，貨號(hào)分別為E-EL-R0012c、E-EL-0567c），pro-Caspase-1、NLRP3一抗（三鷹生物，貨號(hào)分別為22915-1-AP、19771-1-AP），Cleaved-Caspase-1（萬(wàn)類生物，貨號(hào)為WL02996a），TUNEL試劑盒（Roche，貨號(hào)11684817910），DAPI（碧云天，貨號(hào)C1002），抗熒光淬滅封片劑（SouthBiotech，貨號(hào)0100-1），Caspase-1一抗（PTG，貨號(hào)22915-1-AP），CY3標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗（JACKSON，貨號(hào)111-165-003）。

栓線（型號(hào)2838-A4，北京西濃），低溫高速離心機(jī)（型號(hào)H1850，湖南湘儀），多功能酶標(biāo)儀（型號(hào)Enspire，美國(guó)Perkinelmer），病理切片機(jī)（型號(hào)RM2016，上海徠卡儀器），電熱恒溫水槽（型號(hào)DK-8AD，上海一恒），HE成像儀（型號(hào)Nikon DS-U3，日本尼康）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后分為假手術(shù)組和造模組，參照Longa等[19]方法制備CIRI大鼠模型。術(shù)前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛腹腔注射3 mL/kg麻醉大鼠，將大鼠固定，術(shù)區(qū)消毒，于頸前縱向剪一2.5 cm切口，分離皮膚、筋膜、肌肉等組織，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈分叉，縫線結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端及頸外動(dòng)脈近分叉處，頸內(nèi)動(dòng)脈近分叉處掛一縫線備用，動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈近心端，用眼科剪距分叉下約4 mm剪一小口，將栓線從開(kāi)口處插入，沿頸總動(dòng)脈推進(jìn)，至分叉處松開(kāi)動(dòng)脈夾，沿頸內(nèi)動(dòng)脈插入，插入距分叉處約18 mm停止，將栓線連同頸內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎。傷口處撒適量青霉素，逐層縫合并常規(guī)消毒，分籠飼養(yǎng)。2 h后將栓線拔出實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈，不插入栓線，其余操作相同。術(shù)后6 h恢復(fù)進(jìn)食。采用Zea-Longa評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分[19]，評(píng)分1～3分大鼠為造模成功。

2.2 分組及給藥

將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、尼莫地平組和活血榮絡(luò)方低、中、高劑量組，每組9只。按人與動(dòng)物體表面積換算給藥劑量，活血榮絡(luò)方低、中、高劑量組給藥劑量分別為5.85、11.7、23.4 g/kg，尼莫地平組給藥劑量為11 mg/kg，灌胃體積1 mL/100 g，假手術(shù)組和模型組灌胃等體積蒸餾水，造模前36 h第1次灌胃，之后每24 h灌胃1次，共3次。

2.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

再灌注24 h后，采用Zea-Longa評(píng)分法[19]對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。

2.4 腦梗死體積測(cè)定

神經(jīng)功能缺損評(píng)分后，各組隨機(jī)選取3只大鼠行TTC染色。先以水合氯醛腹腔注射3 mL/kg麻醉，快速斷頭取腦，-20 ℃冰箱速凍約20 min。沿冠狀面將大腦連續(xù)切片，厚約2 mm，將腦組織放入2%TTC染液中，37 ℃水浴鍋避光染色30 min。生理鹽水沖洗后，加入4%多聚甲醛浸泡固定。腦組織染色后，正常區(qū)域呈紅色，梗死區(qū)呈白色。用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量各腦片總面積及梗死面積，計(jì)算腦梗死體積百分比（梗死區(qū)體積÷正常側(cè)大腦體積×100%）。

2.5 HE染色

取大鼠腦組織行石蠟包埋，經(jīng)切片、脫蠟、染色、脫水、封片等步驟后，于400倍光學(xué)顯微鏡下分別觀察海馬及皮質(zhì)區(qū)病理形態(tài)。

2.6 ELISA檢測(cè)

大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，腹主動(dòng)脈采血，室溫靜置1 h，3500 r/min離心15 min，取血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-1β、IL-18含量。

2.7 Western blot檢測(cè)

再灌注24 h后，麻醉大鼠取腦，冰上剝?nèi)『ｑR組織，洗滌后放入凍存管，液氮中速凍，于-80 ℃冰箱保存。海馬組織加入1 mL裂解液，勻漿后于冰上靜置30 min，4 ℃、12000 r/min離心5 min，分離上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔上樣量10 μg，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h，滴加一抗（β-actin 1∶8000、NLRP31∶1000、pro-Casepase-11∶2000、Cleaved-Caspase-11∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min。加山羊抗兔二抗（1∶8000），37 ℃孵育1 h，洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影，用Image Lab軟件檢測(cè)條帶灰度值，以目的蛋白/β-actin灰度值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.8 免疫組化檢測(cè)

取腦組織石蠟切片，抗原修復(fù)，封閉，滴加Caspase-1一抗（1∶100），4 ℃孵育過(guò)夜，二抗孵育，DAB顯色，脫水封片后，顯微鏡下觀察，陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色，觀察相同部位海馬及皮質(zhì)區(qū)5個(gè)非重疊視野，計(jì)算平均光密度。

2.9 免疫熒光雙染

取石蠟切片，抗原修復(fù)，封閉，洗滌，滴加Cleaved-Caspase-1一抗和TUNEL染液，4 ℃孵育過(guò)夜，熒光二抗孵育，洗滌，DAPI染細(xì)胞核，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。Cleaved-Caspase-1陽(yáng)性呈紅色熒光，TUNEL陽(yáng)性呈綠色熒光，DAPI陽(yáng)性呈藍(lán)色熒光，取皮質(zhì)區(qū)相同部位，計(jì)算焦亡陽(yáng)性細(xì)胞率[（Cleaved-Caspase-1+TUNEL+DAPI）陽(yáng)性細(xì)胞÷DAPI陽(yáng)性細(xì)胞]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，經(jīng)正態(tài)分析及方差齊性檢驗(yàn)后，方差齊用方差分析，多組間比較用LSD檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 活血榮絡(luò)方對(duì)模型大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，活血榮絡(luò)方中、高劑量組和尼莫地平組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較（±s，分）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較（±s，分）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組活血榮絡(luò)方低劑量組活血榮絡(luò)方中劑量組活血榮絡(luò)方高劑量組尼莫地平組神經(jīng)功能缺損評(píng)分02.56±0.53**2.44±0.531.56±0.53#1.67±0.50#1.44±0.52##只數(shù)劑量/（g/kg）9999995.8511.723.40.011

4.2 活血榮絡(luò)方對(duì)模型大鼠腦梗死體積的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死體積百分比明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，活血榮絡(luò)方中、高劑量組及尼莫地平組大鼠腦梗死體積百分比明顯減少（P＜0.01）；與活血榮絡(luò)方中劑量組比較，活血榮絡(luò)方高劑量組大鼠腦梗死體積百分比明顯增加（P＜0.01）。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 各組大鼠腦片比較（TTC染色）

表2 各組大鼠腦梗死體積比較（±s，%）

表2 各組大鼠腦梗死體積比較（±s，%）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與活血榮絡(luò)方中劑量組比較，△△P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組活血榮絡(luò)方低劑量組活血榮絡(luò)方中劑量組活血榮絡(luò)方高劑量組尼莫地平組腦梗死體積百分比019.43±2.38**17.24±1.166.40±1.10##11.04±2.79##△△6.26±1.42##只數(shù)劑量/（g/kg）3333335.8511.723.40.011

4.3 活血榮絡(luò)方對(duì)模型大鼠海馬及皮質(zhì)區(qū)形態(tài)的影響

假手術(shù)組大鼠海馬及皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元排列整齊、分布均勻，胞體未見(jiàn)明顯空泡；模型組大鼠海馬及皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元分布散亂，胞體縮小變形，核固縮明顯，核仁裂解消失；活血榮絡(luò)方低劑量組大鼠海馬及皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元胞核固縮、胞體變形，部分神經(jīng)元壞死；活血榮絡(luò)方中劑量組和尼莫地平組大鼠海馬及皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元損傷明顯好轉(zhuǎn)，神經(jīng)元排列規(guī)則，可見(jiàn)少許變性神經(jīng)元；活血榮絡(luò)方高劑量組大鼠海馬及皮質(zhì)區(qū)部分細(xì)胞空泡化，較活血榮絡(luò)方中劑量組神經(jīng)元密度減少，細(xì)胞碎片增多。見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 各組大鼠海馬區(qū)形態(tài)（HE染色，標(biāo)尺=50 μm）

圖3 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)形態(tài)（HE染色，標(biāo)尺=50 μm）

4.4 活血榮絡(luò)方對(duì)模型大鼠血清白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-18含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-18含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，活血榮絡(luò)方中、高劑量組和尼莫地平組大鼠血清IL-1β、IL-18含量明顯減少（P＜0.01），且活血榮絡(luò)方中劑量組作用更明顯（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-18含量比較（±s，pg/mL）

表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-18含量比較（±s，pg/mL）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與活血榮絡(luò)方中劑量組比較，△△P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組活血榮絡(luò)方低劑量組活血榮絡(luò)方中劑量組活血榮絡(luò)方高劑量組尼莫地平組劑量/（g/kg）只數(shù)3333335.8511.723.40.011 IL-1818.69±2.6873.50±3.15**68.78±1.7032.36±3.05##44.87±4.17##△△28.62±4.31##IL-1β 65.06± 6.19173.98±14.61**158.98± 5.2884.37± 1.11##109.07±12.07##△△75.96± 6.30##

4.5 活血榮絡(luò)方對(duì)模型大鼠海馬組織NLRP3、pro-Caspase-1、Cleaved-Caspase-1蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織NLRP3、pro-Caspase-1、Cleaved-Caspase-1蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，活血榮絡(luò)方中、高劑量組和尼莫地平組大鼠海馬組織NLRP3、pro-Caspase-1、Cleaved- Caspase-1蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與活血榮絡(luò)方中劑量組比較，活血榮絡(luò)方高劑量組pro-Caspase-1、Cleaved-Caspase-1蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖4、表4。

圖4 各組大鼠海馬組織NLRP3、pro-Caspase-1、Cleaved-Caspase-1蛋白免疫印跡

表4 各組大鼠海馬組織NLRP3、pro-Caspase-1、Cleaved-Caspase-1蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠海馬組織NLRP3、pro-Caspase-1、Cleaved-Caspase-1蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與活血榮絡(luò)方中劑量組比較，△P＜0.05

Cleaved-Caspase-11.00±0.152.90±0.38**2.44±0.231.34±0.25##1.97±0.30##△1.53±0.26##組別假手術(shù)組模型組活血榮絡(luò)方低劑量組活血榮絡(luò)方中劑量組活血榮絡(luò)方高劑量組尼莫地平組只數(shù)劑量/（g/kg）3333335.8511.723.40.011 NLRP31.00±0.282.77±0.19**2.66±0.381.50±0.07##1.84±0.07##1.32±0.30##pro-Caspase-11.00±0.263.00±0.29**2.38±0.33#1.18±0.23##1.89±0.29##△1.58±0.29##

4.6 活血榮絡(luò)方對(duì)模型大鼠海馬及皮質(zhì)區(qū)Caspase-1表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)及皮質(zhì)區(qū)Caspase-1表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，活血榮絡(luò)方中、高劑量組和尼莫地平組大鼠海馬CA1區(qū)及皮質(zhì)區(qū)Caspase-1表達(dá)明顯降低（P＜0.05），以活血榮絡(luò)方中劑量組變化最明顯（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖5、表5。

圖5 各組大鼠海馬及皮質(zhì)區(qū)Caspase-1陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

表5 各組大鼠海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)區(qū)Caspase-1表達(dá)比較（±s，×10-2）

表5 各組大鼠海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)區(qū)Caspase-1表達(dá)比較（±s，×10-2）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與活血榮絡(luò)方中劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組活血榮絡(luò)方低劑量組活血榮絡(luò)方中劑量組活血榮絡(luò)方高劑量組尼莫地平組劑量/（g/kg）皮質(zhì)區(qū)0.31±0.061.39±0.11**1.25±0.160.58±0.08##0.85±0.07##△△0.44±0.09##只數(shù)3333335.8511.723.40.011海馬CA1區(qū)2.50±0.5510.14±0.57**9.18±1.044.11±0.39##5.47±0.08##△3.86±0.67##

4.7 活血榮絡(luò)方對(duì)模型大鼠皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞焦亡的影響

焦亡細(xì)胞表現(xiàn)為Cleaved-Caspase-1+TUNEL+DAPI陽(yáng)性。假手術(shù)組皮質(zhì)區(qū)可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞（綠色熒光），未見(jiàn)焦亡陽(yáng)性細(xì)胞。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠皮質(zhì)區(qū)焦亡陽(yáng)性細(xì)胞率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，活血榮絡(luò)方中、高劑量組和尼莫地平組大鼠皮質(zhì)區(qū)焦亡陽(yáng)性細(xì)胞率明顯降低（P＜0.01）；與活血榮絡(luò)方中劑量組比較，活血榮絡(luò)方高劑量組焦亡陽(yáng)性細(xì)胞率明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表6、圖6。

圖6 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞焦亡陽(yáng)性表達(dá)（免疫熒光染色，×400）

表6 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)焦亡陽(yáng)性細(xì)胞率比較（±s）

表6 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)焦亡陽(yáng)性細(xì)胞率比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與活血榮絡(luò)方中劑量組比較，△P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組活血榮絡(luò)方低劑量組活血榮絡(luò)方中劑量組活血榮絡(luò)方高劑量組尼莫地平組焦亡陽(yáng)性細(xì)胞率00.17±0.28**0.15±0.160.06±0.01##0.10±0.02##△0.05±0.02##只數(shù)劑量/（g/kg）3333335.8511.723.40.011

5 討論

細(xì)胞焦亡作為炎癥細(xì)胞的死亡方式，能擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，加劇CIRI。NLRP3炎癥小體在介導(dǎo)細(xì)胞焦亡中發(fā)揮重要作用[20-21]。細(xì)胞受外界刺激后，激活炎癥復(fù)合物，活化Caspase-1，其既能作為直接激動(dòng)劑使IL-1β和IL-18前體自身切割，釋放出胞外募集其他炎癥細(xì)胞，加重炎癥反應(yīng)，又能剪切GSDMD，釋放出活性N端（GSDMD-N）與質(zhì)膜內(nèi)層磷脂結(jié)合，加速核孔形成，釋放成熟形式的炎癥因子誘導(dǎo)焦亡[22-25]。炎癥反應(yīng)又進(jìn)一步促進(jìn)NLRP3炎癥小體激活，形成惡性循環(huán)，加重疾病。CIRI發(fā)生時(shí)，機(jī)體血腦屏障功能減弱，外周炎癥細(xì)胞及中樞神經(jīng)系統(tǒng)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放出促炎因子，造成NLRP3、Caspase-1、IL-1β等炎癥介質(zhì)高表達(dá)，使膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元死亡。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立CIRI大鼠模型，觀察NLRP3炎癥小體在CIRI中的作用及活血榮絡(luò)方的調(diào)控機(jī)制。神經(jīng)功能缺損評(píng)分發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著增加，而活血榮絡(luò)方各劑量組能不同程度降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分，減輕腦損傷。結(jié)合大鼠腦梗死體積分析，說(shuō)明活血榮絡(luò)方對(duì)模型大鼠有神經(jīng)保護(hù)作用。通過(guò)HE染色和免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬及皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元減少，核仁消失、核固縮明顯，Caspase-1表達(dá)明顯升高，而活血榮絡(luò)方對(duì)模型大鼠病理形態(tài)和Caspase-1表達(dá)均有一定程度改善，且活血榮絡(luò)方中、高劑量組改善較為明顯。Western blot及ELISA結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織NLRP3、pro-Caspase-1、Cleaved-Caspase-1和血清IL-1β、IL-18水平明顯升高，提示腦缺血后NLRP3炎癥小體通過(guò)活化Caspase-1與下游細(xì)胞因子共同作用，介導(dǎo)經(jīng)典焦亡途徑的激活，進(jìn)一步加重缺血性腦損傷?；钛獦s絡(luò)方中、高劑量組海馬組織NLRP3、pro-Caspase-1、Cleaved-Caspase-1蛋白表達(dá)降低，血清IL-18、IL-1β含量減少，說(shuō)明活血榮絡(luò)方可能通過(guò)該途徑發(fā)揮腦保護(hù)作用。最后通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞焦亡，結(jié)合焦亡經(jīng)典途徑驗(yàn)證活血榮絡(luò)方可能通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡減輕CIRI，且中劑量活血榮絡(luò)方效果最顯著，與尼莫地平相當(dāng)。

綜上，活血榮絡(luò)方能改善大鼠CIRI，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡、減輕炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)相關(guān)。本研究闡明了活血榮絡(luò)方治療CIRI的部分機(jī)制，今后將繼續(xù)深入探索其潛在靶點(diǎn)及作用機(jī)制。