丁富勇 ，劉喜平 ，陳啟明 ，戴麗蓉 ，王慶苗 ，施麗娟 ，朱中博 ，何玲

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000； 3.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

半夏瀉心湯是治療寒熱錯雜痞證的經(jīng)典名方，出自《傷寒雜病論》，具有平調(diào)寒熱、消痞散結(jié)之效。用于治療肝癌、胃癌等消化道腫瘤及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移已有眾多臨床報道[1-3]，療效肯定。本課題組前期實驗研究表明，半夏瀉心湯對胃癌荷瘤裸鼠有明顯抑瘤作用[4]，且可抑制人胃癌細(xì)胞生長增殖[5-6]。同時研究發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯含藥血清可保護胃癌上清液對腹膜間皮細(xì)胞的損傷[7]，抑制人胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移[8]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，分離人胃癌NCI-N87細(xì)胞外泌體，通過NCI-N87細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5，觀察半夏瀉心湯含藥血清對胃癌細(xì)胞來源外泌體誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞纖維連接蛋白1（FN1）和層粘連蛋白γ1（LAMC1）表達及胃癌細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞黏附、侵襲的影響，探討半夏瀉心湯防治胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的機制。

1 實驗材料

1.1 藥物

半夏瀉心湯（法半夏12 g，干姜9 g，黃芩9 g，黃連3 g，人參9 g，大棗4枚，炙甘草9 g），飲片由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院景明教授鑒定符合2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。全方藥物混合并浸泡30 min，煎煮2次，第1次加8倍量水，煎煮1.5 h，第2次加6倍量水，煎煮1 h，合并煎液，過濾，濾液減壓濃縮至原藥材濃度為2.7、1.35、0.675 g/mL，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 動物與細(xì)胞

SPF級雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量200～250 g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（甘）2020-0001，動物使用許可證號SYXK（甘）2020-0009。飼養(yǎng)于溫度23～25 ℃、相對濕度50%±10%的SPF級實驗室。本研究動物實驗經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（2018-009）。

人腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5、人胃癌NCI-N87細(xì)胞，購自上海中科院細(xì)胞庫，傳至第3代備用。

1.3 試劑與儀器

FN1 ELISA檢測試劑盒（深圳子科生物科技有限公司，批號ZK-H1730），LAMC1 ELISA檢測試劑盒（上海研尊生物科技有限公司，批號YZ-E987777），BCA蛋白定量試劑盒（上海易色醫(yī)療科技有限公司，批號BC201），外泌體提取試劑盒（美國SBI，批號EXOTC50A-1），RNA提取試劑盒（日本Takara公司，批號9767），兔來源CD63一抗（英國Abcam公司，批號ab134045），兔來源CD9一抗（英國Abcam公司，批號ab92726），兔來源鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin）一抗（英國Abcam公司，批號ab92516），羊抗兔IgG（英國Abcam公司，批號ab150077），DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號11995-065），胎牛血清（美國Gibco公司，批號HLC0101），基質(zhì)膠（美國Corning公司，批號356234），CFSE染色劑（美國Bioscience公司，批號65-0850-84）。

7500型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司），ECLIPSE Ti型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司），TDL-50B型低速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），353097型8 μm Transwell小室（美國Costar公司），實時熒光定量PCR儀（美國ABI Stepone plus公司），DYCP-31DN型電泳儀（北京六一生物科技有限公司），Trans-blot轉(zhuǎn)膜裝置（美國Bio-Rad公司），Tanon-4200型凝膠成像系統(tǒng)（中國Tanon公司），Multiskan Mk3酶標(biāo)儀（賽默飛世爾儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 含藥血清制備

按照前期方法制備半夏瀉心湯[9]和5-氟尿嘧啶（5-FU）[10]含藥血清，將40只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、5-FU組和半夏瀉心湯低、中、高劑量組，每組8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，半夏瀉心湯低、中、高劑量組每日分別予相應(yīng)溶液13.5、27、54 g/kg灌胃，其余各組灌胃等體積生理鹽水，2 mL/次，2次/d；5-FU組按0.015 g/kg尾靜脈注射5-FU注射液（0.125 g/5 mL），其余各組注射等體積空白溶劑，連續(xù)2周。末次給藥后1 h，3%戊巴比妥鈉1.5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采集全血，靜置分層后3000 r/min離心10 min，收集血清，56 ℃水浴滅活30 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，混勻分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。臨用時配制成10%含藥血清。

2.2 NCI-N87細(xì)胞外泌體分離

用無外泌體完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素）培養(yǎng)NCI-N87細(xì)胞后，4 ℃、1500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4 ℃、5000 r/min離心20 min，0.22 μm濾膜過濾去除較大囊泡，將過濾后的細(xì)胞上清液與外泌體提取試劑以5∶1比例混勻，4 ℃孵育過夜，10000 r/min低速離心30 min，棄上清液，所得沉淀用0.5 mL無菌PBS重懸，即得外泌體。取適量外泌體，采用BCA蛋白定量試劑盒進行定量后，于-80 ℃冰箱保存。

2.3 NCI-N87細(xì)胞外泌體鑒定

將外泌體以PBS稀釋至合適濃度，加入Formvarcarbon載樣銅網(wǎng)上，將銅網(wǎng)用2.5%戊二醛固定，移至包被碳膜的微柵網(wǎng)，滴加草酸雙氧鈾及甲基纖維素-UA液50 μL，置于透射電鏡下觀察外泌體形態(tài)，80 kV拍照并保存。

取外泌體和NCI-N87細(xì)胞，加入6×蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min變性，以20 μg總蛋白上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜、洗滌、封閉后，分別加CD9、CD63、calreticulin一抗（1∶1000），4 ℃孵育過夜，洗滌，室溫孵育二抗（1∶1000）2 h，洗滌，ECL化學(xué)發(fā)光液（A液與B液等比例混合）顯影，Image J軟件分析CD9、CD63、calreticulin蛋白灰度值。

2.4 ELISA檢測HMrSV5細(xì)胞纖維連接蛋白1和層粘連蛋白γ1含量

將對數(shù)期HMrSV5細(xì)胞用胰酶消化，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為濃度2×105個/mL，將細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔100 μL，將細(xì)胞分為正常對照組、模型組、5-FU組和半夏瀉心湯低、中、高劑量組，每組3個復(fù)孔。將“2.2”項下分離的NCI-N87細(xì)胞外泌體用含相應(yīng)大鼠血清的完全培養(yǎng)基稀釋[11]，正常對照組加入10%正常對照大鼠血清培養(yǎng)基（無外泌體）1 mL，模型組加入10%正常對照大鼠血清培養(yǎng)基（外泌體濃度為100 μg/mL）1 mL，5-FU組加入10%5-FU大鼠血清培養(yǎng)基（外泌體濃度為100 μg/mL）1 mL，半夏瀉心湯低、中、高劑量組分別加入10%半夏瀉心湯低、中、高劑量含藥血清培養(yǎng)基（外泌體濃度均為100 μg/mL）1 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于24、48、72 h后終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞上清液，10000 r/min離心15 min，去除細(xì)胞碎片，按照ELISA檢測試劑盒說明書檢測FN1和LAMC1含量。

2.5 RT-qPCR檢測HMrSV5細(xì)胞纖維連接蛋白1和層粘連蛋白γ1 mRNA表達

收集“2.4”項下培養(yǎng)72 h的HMrSV5細(xì)胞，使用Trizol試劑提取總RNA。取5 μg RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板，采用熒光定量PCR試劑盒進行PCR。反應(yīng)條件：50 ℃、2 min，95 ℃、2 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，計算循環(huán)閾值（Ct），采用2-ΔΔCt法計算FN1、LAMC1 mRNA相對表達量。引物由重慶威斯騰科技公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.6 NCI-N87細(xì)胞和HMrSV5細(xì)胞黏附檢測

取對數(shù)期NCI-N87細(xì)胞，胰酶消化，收集細(xì)胞沉淀，PBS洗2遍，加入適量5 μmol/L CFSE染液避光孵育20 min。收集CFSE標(biāo)記的胃癌細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL，避光備用。將NCI-N87細(xì)胞懸液100 μL加入“2.4”項下分組培養(yǎng)72 h的HMrSV5細(xì)胞中，同時設(shè)置空白孔（含10%正常對照大鼠血清的完全培養(yǎng)基）及對照孔（NCI-N87細(xì)胞懸液100 μL），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1 h。棄去培養(yǎng)液，PBS洗3次，洗脫未結(jié)合的NCI-N87細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞黏附情況，熒光酶標(biāo)儀激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長530 nm讀取各孔熒光強度，計算細(xì)胞黏附率。細(xì)胞黏附率（%）=（實驗組熒光強度-空白孔熒光強度）÷（對照孔熒光強度-空白孔熒光強度）×100%。

2.7 NCI-N87細(xì)胞對HMrSV5細(xì)胞侵襲檢測

在Transwell上室加入稀釋的基質(zhì)膠50 μL，將密度為5×104個/mL NCI-N87細(xì)胞懸液200 μL接種到Transwell上室，下室接種“2.4”項下培養(yǎng)72 h的HMrSV5細(xì)胞（密度2×105個/mL）0.5 mL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h。取出Transwell小室，棄去培養(yǎng)基，以無菌棉棒輕輕擦去上室殘留細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定上室底面細(xì)胞，室溫放置15 min，PBS洗去固定液，結(jié)晶紫染色30 min，PBS沖洗后顯微鏡下觀察并拍照，在100倍視野下，對膜中間和四周5個視野的染色細(xì)胞進行計數(shù)，取平均值。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以±s表示，組間比較經(jīng)方差齊性檢驗后用方差分析并進行多重比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 外泌體鑒定

透射電鏡觀察到NCI-N87細(xì)胞外泌體有完整的雙層包膜，形成橢圓或碟狀的囊泡結(jié)構(gòu)，內(nèi)含低密度物質(zhì)，粒徑介于40～80 nm，見圖1。

圖1 NCI-N87細(xì)胞外泌體形態(tài)

CD9、CD63是外泌體標(biāo)志蛋白，calreticulin是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)主要的鈣離子結(jié)合蛋白。Western blot檢測結(jié)果顯示，外泌體CD9、CD63蛋白表達明顯高于NCI-N87細(xì)胞，而calreticulin蛋白表達明顯低于NCI-N87細(xì)胞，見圖2。提示獲得了NCI-N87細(xì)胞來源外泌體。

圖2 NCI-N87細(xì)胞及外泌體CD9、CD63、calreticulin蛋白免疫印跡

4.2 半夏瀉心湯含藥血清對HMrSV5細(xì)胞纖維連接蛋白1和層粘連蛋白γ1含量的影響

與正常對照組比較，各時間點模型組HMrSV5細(xì)胞上清液FN1和LAMC1含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，半夏瀉心湯低、中、高劑量組HMrSV5細(xì)胞上清液FN1和LAMC1含量明顯減少（P＜0.01）；與本組48 h比較，培養(yǎng)72 h HMrSV5細(xì)胞上清液FN1和LAMC1含量明顯增加（P＜0.01），見表2。因此后續(xù)實驗選擇含藥血清培養(yǎng)72 h。

表2 各組HMrSV5細(xì)胞上清液FN1和LAMC1含量比較（±s，ng/mL）

表2 各組HMrSV5細(xì)胞上清液FN1和LAMC1含量比較（±s，ng/mL）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與48 h比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別正常對照組模型組5-FU組半夏瀉心湯低劑量組半夏瀉心湯中劑量組半夏瀉心湯高劑量組n333333 FN1 LAMC172 h 0.12±0.019.65±0.45##2.80±0.36**6.07±0.61**△△5.09±0.35**△△3.42±0.63**△△24 h 13.12±0.2220.12±0.12##10.68±0.24**13.41±0.17**△△14.41±0.33**△△13.67±0.23**△△48 h 16.34±0.1525.64±0.24##16.56±0.37**19.82±0.42**17.38±0.12**18.12±0.45**72 h 25.36±0.3248.80±0.55##30.30±0.14**39.16±0.33**△△38.46±0.63**△△32.12±0.42**△△24 h 0.05±0.025.43±0.41##0.78±0.23**2.45±0.58**△1.46±0.32**△0.87±0.43**48 h 0.07±0.236.37±0.23##1.17±0.25**3.42±0.45**2.34±0.26**1.34±0.32**

4.3 半夏瀉心湯含藥血清對HMrSV5細(xì)胞纖維連接蛋白1和層粘連蛋白γ1 mRNA表達的影響

與正常對照組比較，模型組HMrSV5細(xì)胞FN1和LAMC1 mRNA表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，半夏瀉心湯低、中、高劑量組HMrSV5細(xì)胞FN1和LAMC1 mRNA表達明顯降低（P＜0.01）。見表3。

表3 各組HMrSV5細(xì)胞FN1和LAMC1 mRNA表達比較（±s）

表3 各組HMrSV5細(xì)胞FN1和LAMC1 mRNA表達比較（±s）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

LAMC11.00±0.013.45±0.03##1.06±0.03**3.27±0.01**2.24±0.02**2.01±0.04**組別正常對照組模型組5-FU組半夏瀉心湯低劑量組半夏瀉心湯中劑量組半夏瀉心湯高劑量組n333333 FN11.00±0.035.00±0.05##3.03±0.04**5.61±0.07**4.64±0.06**4.12±0.02**

4.4 半夏瀉心湯含藥血清對NCI-N87細(xì)胞和HMrSV5細(xì)胞黏附的影響

與正常對照組比較，模型組NCI-N87細(xì)胞和HMrSV5細(xì)胞黏附率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，半夏瀉心湯中、高劑量組NCI-N87細(xì)胞和HMrSV5細(xì)胞黏附率明顯降低（P＜0.01）。見圖3、表4。

圖3 各組NCI-N87、HMrSV5細(xì)胞黏附（CFSE染色，×100）

表4 各組NCI-N87、HMrSV5細(xì)胞黏附率比較（±s，%）

表4 各組NCI-N87、HMrSV5細(xì)胞黏附率比較（±s，%）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

黏附率12.29±0.9731.03±1.12##8.08±0.45**23.48±1.3418.83±1.09**15.10±0.94**組別正常對照組模型組5-FU組半夏瀉心湯低劑量組半夏瀉心湯中劑量組半夏瀉心湯高劑量組n333333

4.5 半夏瀉心湯含藥血清對NCI-N87細(xì)胞向HMrSV5細(xì)胞侵襲的影響

與正常對照組比較，模型組NCI-N87細(xì)胞向HMrSV5細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，半夏瀉心湯低、中、高劑量組NCI-N87細(xì)胞向HMrSV5細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4、表5。

圖4 各組NCI-N87細(xì)胞向HMrSV5細(xì)胞侵襲（結(jié)晶紫染色，×100）

表5 各組NCI-N87細(xì)胞向HMrSV5細(xì)胞侵襲數(shù)量比較（±s，個）

表5 各組NCI-N87細(xì)胞向HMrSV5細(xì)胞侵襲數(shù)量比較（±s，個）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

侵襲數(shù)量20.20±5.6154.27±4.28##22.55±5.23**40.67±3.14*34.07±2.34**26.53±1.14**組別正常對照組模型組5-FU組半夏瀉心湯低劑量組半夏瀉心湯中劑量組半夏瀉心湯高劑量組n333333

5 討論

腹膜轉(zhuǎn)移是胃癌患者最常見的復(fù)發(fā)形式之一[12]，其中癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤剝離形成游離癌細(xì)胞，并與腹膜間皮細(xì)胞黏附，進而侵入腹膜是形成腹膜轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腹膜間皮細(xì)胞是覆蓋在腹膜最表層的細(xì)胞，是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移種植的抵御屏障[13]。已有研究表明，腹膜內(nèi)游離癌細(xì)胞存在并不一定發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移，腹膜間皮細(xì)胞表型和功能改變是促進游離癌細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞黏附、增強癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的關(guān)鍵因素[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在癌細(xì)胞定植于腹膜間皮細(xì)胞前，腹膜間皮細(xì)胞已發(fā)生表型和功能改變，為癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利微環(huán)境[15]。

胃癌腹膜轉(zhuǎn)移主要病機為脾胃升降失調(diào)，半夏瀉心湯為辛開苦降法的代表方劑，方中法半夏、干姜辛開以化痰散結(jié)，黃連、黃芩苦降以清解癌毒，人參、大棗、甘草甘補以健脾補虛。全方寒熱互用以和其陰陽、辛開苦降以調(diào)其升降、補瀉兼施以顧其虛實，共奏化痰散結(jié)、健脾補虛、清解癌毒之功。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯能有效預(yù)防胃癌根治術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[3]，保護胃癌上清液對腹膜間皮細(xì)胞的損傷[7]，抑制人胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移[8，16]。

外泌體是一類直徑為50～100 nm的內(nèi)吞衍生囊泡，是細(xì)胞間通訊的重要載體，各種類型細(xì)胞均可分泌外泌體，相對于普通細(xì)胞，癌細(xì)胞可分泌大量外泌體，在促進腫瘤轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用[17-18]。外泌體可富集、包裹細(xì)胞外的miRNA、mRNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子等多種生物信息物質(zhì)，并將其遠(yuǎn)距離傳遞至受體細(xì)胞，內(nèi)化后激活胞內(nèi)信號通路及蛋白表達，對受體細(xì)胞生物學(xué)特性進行精細(xì)調(diào)節(jié)[19]。研究表明，胃癌患者血液中外泌體含量較健康人群明顯增加，且其攜帶的生物信息物質(zhì)與健康人群也明顯不同[20]，并證實胃癌來源的外泌體能誘發(fā)腹膜間皮細(xì)表型和功能改變，參與癌細(xì)胞在腹膜擴散發(fā)展，促進胃癌腹膜轉(zhuǎn)移[21]。

FN1是大分子的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，LAMC1是存在于基底膜中的非膠原糖蛋白，2種蛋白均參與多種生物過程，包括組織、胚胎發(fā)育，傷口愈合等[22-23]，尤其FN1是促進幾乎所有種類癌細(xì)胞形成和發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子[24]。同時，F(xiàn)N1和LAMC1作為重要的細(xì)胞黏附相關(guān)分子，通過細(xì)胞外基質(zhì)中精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸組成的短肽序列識別整合素家族介導(dǎo)的細(xì)胞黏附與遷移，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[25-26]。PCR陣列表明，F(xiàn)N1和LAMC1在腫瘤來源外泌體誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞中表達顯著上調(diào)，進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N1和LAMC1表達上調(diào)與外泌體中miRNA等生物信息物質(zhì)向腹膜間皮細(xì)胞傳遞有關(guān)[27]。

本研究結(jié)果顯示，在胃癌細(xì)胞NCI-N87來源外泌體誘導(dǎo)下，各劑量半夏瀉心湯均可減弱NCI-N87細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5黏附能力及胃癌細(xì)胞的侵襲能力，降低HMrSV5細(xì)胞FN1和LAMC1蛋白及mRNA表達。表明半夏瀉心湯含藥血清可通過調(diào)節(jié)胃癌來源外泌體誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞FN1和LAMC1表達，保護腹膜間皮細(xì)胞，增強腹膜間皮細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的抵御，防止胃癌細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞黏附及向腹膜侵襲，這可能是半夏瀉心湯治療胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的作用機制之一。