毛凱榮 ，熊羅節(jié) ，田岳鳳 ，徐小珊 ，翟春濤 ，李瑋

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518034； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619

機(jī)體免疫系統(tǒng)能夠通過(guò)識(shí)別“自己”與“非己”，從而祛除對(duì)人體產(chǎn)生危害的抗原，并對(duì)人體自身產(chǎn)生的不利于發(fā)揮正常生理功能的細(xì)胞或損傷進(jìn)行清除或修復(fù)?！罢龤獯鎯?nèi)，邪不可干”（《素問(wèn)·刺法論篇》），正氣的作用就是抵御病邪?！瓣庩?yáng)俱虛，火自當(dāng)之”（《靈樞·官能》），艾灸有補(bǔ)虛培元作用，能治療由于正氣虛而引起的慢性病癥。現(xiàn)代研究從不同角度證實(shí)艾灸與免疫有密切關(guān)系[1-2]。

課題組前期研究表明，隔藥餅灸能通過(guò)調(diào)控免疫細(xì)胞和相關(guān)分子，一定程度上改善和恢復(fù)免疫抑制狀態(tài)的機(jī)體免疫功能[3]。在此基礎(chǔ)上，本研究從隔藥餅灸通過(guò)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（Breg）介導(dǎo)的TIGIT/CD155和JAK2/STAT3信號(hào)通路出發(fā)，探究其影響免疫功能的機(jī)制及不同指標(biāo)間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

普通級(jí)日本大耳白兔32只，雌雄各半，體質(zhì)量（2.3±0.3）kg，北京西山昌揚(yáng)養(yǎng)殖中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0007。飼養(yǎng)于溫度20～24 ℃、相對(duì)濕度40%～60%環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見(jiàn)》相關(guān)規(guī)定，并通過(guò)山西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2016DW019）。

1.2 藥物及制備

熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、茯苓、牡丹皮，由山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供。艾絨購(gòu)于北京同仁堂中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào)1808026。用模具將艾絨制成半徑0.3 cm、高0.5 cm、質(zhì)量為（0.3±0.03）g圓錐形艾炷。用卷煙器將質(zhì)量為（1.5±0.25）g的艾絨制成艾條。

將熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、茯苓、牡丹皮按8∶4∶4∶3∶3∶3比例混合后過(guò)120目篩磨成粉，將藥粉、賦形劑（小麥粉）和水按1∶1∶1.2比例混合均勻，使用模具制成半徑0.4 cm、高0.4 cm、質(zhì)量為（0.9±0.05）g藥餅。

1.3 主要試劑與儀器

環(huán)磷酰胺（批號(hào)22011925），江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司；白細(xì)胞介素（IL）-10、CD155、TIGIT ELISA試劑盒（批號(hào)均為20210703A），上海酶聯(lián)生物科技有限公司；JAK2抗體（批號(hào)FL-6001）、STAT3抗體（批號(hào)714094），北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TIGIT抗體（批號(hào)PAB180017），艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；增強(qiáng)型RIPA裂解液（批號(hào)AR0102），武漢博士德生物工程有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)AR0146），武漢博士德生物工程有限公司；75%醫(yī)用乙醇（批號(hào)20191002），山東安捷高科消毒科技有限公司。

電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)DYCZ-24DN），電轉(zhuǎn)儀（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)DYCZ-40B），酶標(biāo)儀（蘭雷勃集團(tuán)，型號(hào)MK3），水浴鍋（德國(guó)徠卡，型號(hào)HI1210），成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號(hào)Tanon-5200），正置顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司，型號(hào)CX41），石蠟切片機(jī)（湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司，型號(hào)SQ2125），數(shù)碼相機(jī)（日本尼康，型號(hào)D510）。

1.4 分組及造模

動(dòng)物按體質(zhì)量采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、模型組、艾條灸組和隔藥餅灸組，每組8只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始造模，將環(huán)磷酰胺用生理鹽水配制成濃度為20 mg/mL溶液，模型組、艾條灸組和隔藥餅灸組按60 mg/kg腹腔注射，連續(xù)7 d[4]，空白組每日腹腔注射等體積生理鹽水。以進(jìn)食量減少、毛色光澤度降低、掉毛量增加和精神狀態(tài)萎靡為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 干預(yù)

參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[5]動(dòng)物腧穴定位法及擬人比照法，選取“神闕”“關(guān)元”“足三里”“脾俞”“腎俞”。艾條灸組先將兔俯臥位固定于兔臺(tái)，使用艾灸架將自制艾條置于雙側(cè)“脾俞”“腎俞”“足三里”上3 cm處，用線(xiàn)香點(diǎn)燃，待俯臥位施灸結(jié)束后，再以仰臥位固定兔，同法于“神闕”“關(guān)元”施灸，每穴每次灸1壯，隔日灸，共10次。隔藥餅灸組先將兔俯臥位固定于兔臺(tái)，將制備的藥餅放于雙側(cè)“脾俞”“腎俞”“足三里”，上置艾炷，用線(xiàn)香點(diǎn)燃艾炷施灸，待俯臥位施灸結(jié)束后，再以仰臥位固定兔，同法于“神闕”“關(guān)元”施灸，每穴每次灸5壯，隔日灸，共10次?？瞻捉M和模型組只固定，不進(jìn)行干預(yù)。

1.6 取材

干預(yù)結(jié)束后次日，20%烏拉坦耳緣靜脈注射5 mL/kg麻醉兔，用采血管采集腹腔靜脈血，血液靜置30 min，3000 r/min離心10 min，血清置于EP管中，-20 ℃保存，用于ELISA檢測(cè)。采血后迅速摘取肝臟和脾臟，切取脾臟上端組織（1.5 cm×1 cm×0.2 cm）、肝右葉中段組織（2 cm×1 cm×1 cm），置于4%多聚甲醛中固定，用于免疫組化檢測(cè)；再切取肝右葉中段組織（2 cm×1 cm×1 cm），置于凍存管中，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot檢測(cè)。

1.7 指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1 ELISA檢測(cè)

根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行樣本稀釋、抗體孵育、底物顯色操作，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm檢測(cè)樣品吸光度（OD值），計(jì)算血清IL-10、TIGIT、CD155含量。

1.7.2 Western blot檢測(cè)

提取肝組織總蛋白，進(jìn)行蛋白定量。制膠，上樣（10 μg），電泳（80 V、60 min，120 V、60 min），轉(zhuǎn)膜（220 mA、100 min），5%BSA 4 ℃封閉2 h，加入JAK2、STAT3一抗（1∶2000），4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗（1∶3000），室溫孵育1 h，顯影，成像。利用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7.3 免疫組化檢測(cè)

取多聚甲醛固定的肝、脾組織，脫水、透明、浸蠟后包埋，制成蠟塊并切片，脫蠟，水化，抗原修復(fù)，封閉，滴加TIGIT一抗（1∶2000），4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗（1∶1000）孵育，脫水透明并封片。每張切片隨機(jī)取4個(gè)200倍視野拍照，采用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料滿(mǎn)足正態(tài)分布用±s表示，多組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)性分析對(duì)IL-10、TIGIT、CD155、JAK2、STAT3兩兩之間相關(guān)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，首先在SPSS中以散點(diǎn)圖判斷兩指標(biāo)間是否存在線(xiàn)性回歸趨勢(shì)，如符合線(xiàn)性趨勢(shì)再進(jìn)一步以最小二乘法建立擬合模型，并以相關(guān)系數(shù)（r）評(píng)價(jià)相關(guān)性。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隔藥餅灸對(duì)模型兔血清白細(xì)胞介素-10、TIGIT、CD155含量的影響

與空白組比較，模型組兔血清IL-10含量顯著減少，TIGIT、CD155含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，艾條灸組和隔藥餅灸組兔血清IL-10含量顯著增加，TIGIT、CD155含量顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組兔血清IL-10、TIGIT、CD155含量比較（±s，pg/mL）

表1 各組兔血清IL-10、TIGIT、CD155含量比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別空白組模型組艾條灸組隔藥餅灸組CD155194.15±6.97251.01±9.69**222.75±5.27##217.56±4.88##只數(shù)8888 IL-10489.02±62.21220.93±65.45**331.42±67.18##432.88±29.11##TIGIT 382.51± 4.48519.10±11.63**445.67± 8.57##445.70±10.95##

2.2 隔藥餅灸對(duì)模型兔肝組織JAK2、STAT3蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組兔肝組織JAK2、STAT3蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，艾條灸組JAK2、STAT3蛋白表達(dá)有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），隔藥餅灸組肝組織JAK2、STAT3蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組兔肝組織JAK2、STAT3蛋白表達(dá)比較（±s，每組8只）

2.3 隔藥餅灸對(duì)模型兔肝組織和脾組織TIGIT表達(dá)的影響

肝組織TIGIT陽(yáng)性表達(dá)主要在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，脾組織TIGIT陽(yáng)性表達(dá)主要位于白髓動(dòng)脈周?chē)馨颓剩喑首攸S色。

與空白組比較，模型組兔肝組織和脾組織TIGIT表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，艾條灸組和隔藥餅灸組兔肝組織、脾組織TIGIT表達(dá)降低。見(jiàn)圖2、圖3、表2。

圖2 各組兔肝組織TIGIT陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色，×200）

圖3 各組兔脾組織TIGIT陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色，×200）

表2 各組兔肝組織和脾組織TIGIT表達(dá)比較（±s，平均光密度）

表2 各組兔肝組織和脾組織TIGIT表達(dá)比較（±s，平均光密度）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

脾組織0.128921±0.017038 0.207435±0.020901**0.148481±0.031946##0.154947±0.014626##組別空白組模型組艾條灸組隔藥餅灸組只數(shù)8888肝組織0.078307±0.007597 0.129103±0.014293**0.090070±0.017162##0.092790±0.012536##

2.4 血清白細(xì)胞介素-10、TIGIT、CD1555與肝組織JAK2、STAT3相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清IL-10與CD155（r=-0.68，P＜0.01）、TIGIT（r=-0.72，P＜0.01）含量呈負(fù)相關(guān)，與肝組織JAK2（r=0.73，P＜0.01）、STAT3（r=0.75，P＜0.01）表達(dá)呈正相關(guān)；血清CD155與TIGIT（r=0.61，P＜0.05）含量呈正相關(guān)，與肝組織JAK2（r=-0.84，P＜0.01）、STAT3（r=-0.86，P＜0.01）表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；血清TIGIT與肝組織JAK2（r=-0.88，P＜0.01）、STAT3（r=-0.89，P＜0.01）表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；肝組織JAK2與STAT3（r=0.98，P＜0.01）表達(dá)呈顯著正相關(guān)。見(jiàn)圖4。

圖4 血清IL-10、TIGIT、CD155與肝組織JAK2、STAT3 Pearson相關(guān)性分析（r）

3 討論

免疫抑制是指在機(jī)體在疾病或應(yīng)激狀態(tài)下出現(xiàn)細(xì)胞因子表達(dá)或分泌異常的一種狀態(tài)。免疫抑制性因子活性增強(qiáng)，免疫活性細(xì)胞數(shù)目減少或亞群改變，免疫器官發(fā)生功能性和器質(zhì)性改變，使機(jī)體防御能力下降。課題組前期研究表明，隔藥餅灸能通過(guò)六味地黃方、腧穴和艾灸的綜合作用，一定程度上改善免疫抑制引起的免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫因子損傷[3]。

Breg是一類(lèi)通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子、調(diào)控T細(xì)胞及直接作用于惡性腫瘤細(xì)胞等多途徑發(fā)揮免疫抑制性作用的B細(xì)胞[6]。其發(fā)揮免疫抑制功能主要通過(guò)IL-10介導(dǎo)相關(guān)信號(hào)通路，影響下游效應(yīng)基因發(fā)揮功能[7]，相關(guān)信號(hào)通路包括JAK2/STAT3信號(hào)通路和TIGIT/CD155信號(hào)通路等[8-9]。在對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠脾細(xì)胞的干預(yù)中發(fā)現(xiàn)，JAK2/STAT3信號(hào)通路活化能促進(jìn)Breg分化和IL-10水平變化[10]。而對(duì)B細(xì)胞特異性缺失T細(xì)胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-1基因的小鼠研究表明，高表達(dá)TIGIT和IL-10的Breg具有強(qiáng)免疫抑制作用[11]。并且有研究表明，TIGIT可能參與Breg相關(guān)反應(yīng)[12]。因此，本研究圍繞與Breg相關(guān)的IL-10/JAK2/STAT3通路及TIGIT/CD155通路，觀(guān)察隔藥餅灸對(duì)免疫抑制的調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果表明，IL-10含量變化與JAK2/STAT3和TIGIT/CD155信號(hào)通路蛋白水平變化存在相關(guān)性，推測(cè)在免疫抑制模型中，存在Breg通過(guò)分泌IL-10介導(dǎo)JAK2/STAT3信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，同時(shí)也可能影響TIGIT/CD155信號(hào)通路的變化，而隔藥餅灸能通過(guò)調(diào)節(jié)以上通路改善免疫抑制狀態(tài)。

JAK2/STAT3信號(hào)通路在腫瘤等免疫異常性疾病中發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用[13]，其水平變化與IL-10水平變化存在相關(guān)性，且IL-10水平變化會(huì)引起JAK2/STAT3信號(hào)通路下游分子變化，從而介導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡及分化[14-15]。本研究相關(guān)性分析結(jié)果也表明，JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平與血清IL-10含量存在相關(guān)性，與上述研究結(jié)果一致。證明在免疫抑制狀態(tài)下，也存在IL-10水平變化引起的JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白表達(dá)的改變，且不同灸法干預(yù)呈現(xiàn)出差異性的調(diào)節(jié)結(jié)果，隔藥餅灸的干預(yù)效果優(yōu)于艾條灸。

TIGIT是繼PD-1之后在腫瘤研究中的又一免疫檢查點(diǎn)受體，CD155是其下游蛋白，TIGIT/CD155信號(hào)通路能負(fù)向調(diào)控免疫反應(yīng)[16]。免疫損傷模型研究表明，IL-10與TIGIT/CD155信號(hào)通路共同參與免疫負(fù)向調(diào)控作用[17]。免疫組化結(jié)果顯示，隔藥餅灸可以降低模型兔脾組織和肝組織TIGIT水平，改善機(jī)體免疫力。且在免疫抑制模型中IL-10水平變化與TIGIT/CD155信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的變化表現(xiàn)出一定的負(fù)相關(guān)性，推測(cè)受Breg介導(dǎo)的IL-10調(diào)控途徑與TIGIT調(diào)控途徑之間或許有共同調(diào)控模式。

脾為中樞免疫器官之一，含有大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體免疫細(xì)胞定居和免疫應(yīng)答發(fā)生的場(chǎng)所。本課題組前期關(guān)于脾臟形態(tài)學(xué)的研究表明，隔藥餅灸能改善模型兔脾臟損傷[18]。同時(shí)，在黑虎掌菌子實(shí)體多糖干預(yù)環(huán)磷酰胺致小鼠免疫抑制實(shí)驗(yàn)中，脾臟p-JAK2、p-STAT3蛋白水平與脾臟指數(shù)成反比，表明JAK2/STAT3信號(hào)通路與脾臟免疫功能的分子機(jī)制相關(guān)[19]。結(jié)合本研究關(guān)于脾臟TIGIT免疫組化結(jié)果顯示，脾臟TIGIT水平變化受模型兔脾臟免疫功能的影響，并且受影響程度與肝組織TIGIT變化水平一致，提示脾臟與肝臟所受調(diào)控機(jī)制可能一致。

以往對(duì)于JAK2/STAT3與TIGIT/CD155之間關(guān)系研究的報(bào)道較少，有關(guān)膀胱癌高通量分析的報(bào)告顯示，TIGIT與JAK2/STAT3存在高度相關(guān)性[20]。本研究通過(guò)對(duì)相關(guān)蛋白不同水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩者之間可能存在一定聯(lián)系，相關(guān)性分析結(jié)果也表明，TIGIT/CD155與JAK2/STAT3之間存在顯著負(fù)相關(guān)性，提示隔藥餅灸對(duì)共抑制分子TIGIT的調(diào)控可能有JAK2/STAT3通路的參與。

綜上，本研究在前期研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，隔藥餅灸改善免疫抑制兔免疫功能是在Breg作用的基礎(chǔ)上，通過(guò)IL-10介導(dǎo)的JAK2/STAT3通路完成的，該調(diào)控軸可能與TIGIT的參與有一定關(guān)系。但是本研究對(duì)于艾灸干預(yù)Breg的機(jī)制研究尚有不足，對(duì)TIGIT是否通過(guò)JAK2/STAT3通路調(diào)控細(xì)胞凋亡等途徑未作更深入的研究，這也是課題組今后的研究方向。